ACC氧化酶活性测定-猕猴桃采后生理与贮藏保鲜

实验4－4　ACC氧化酶活性测定

一、基本原理

ACC氧化酶（ACO）能催化1-氨基环丙烷-1-羧酸（ACC）转化形成乙烯。通过测定ACO催化产生的乙烯释放量的大小可以反映ACO的催化能力。

二、仪器及试剂

（一）仪器及用具

研钵、高速冷冻离心机、移液器、水浴锅、旋涡混合仪、旋转蒸发仪、样品瓶（20 ml，带有密封橡胶塞）、离心管、气相色谱仪、CO₂气体。

（二）试剂

1．0．1 mol/L、p H 7．5 Tris—盐酸缓冲液

母液A（0．2 mol/L Tris）：称取24．2 g三羟甲基氨基甲烷（Tris），溶解、定容至1000 ml。

母液B（0．2 mol/L HCl）：取16．67 ml浓盐酸，加入到蒸馏水中，稀释至1000 ml。

取50 ml母液A，加入39．9 ml母液B混合，待冷却至室温时，调节p H至7．5，再稀释至100 ml。

2．提取缓冲液

取10 ml甘油，称取5 g PVP、77．1 mg DTT、648 mg抗坏血酸钠（C₆ H₇ O₆ Na·H₂ O）和278 mg FeSO₄·7H₂ O，用0．1 mol/L、p H 7．5 Tris－盐酸缓冲液溶解，并定容至100 ml，即为提取缓冲液［含10%甘油（体积分数）、5% PVP、5．0 mmol/L DTT、30 mmol/L抗坏血酸钠和0．1 mmol/L FeSO₄］。

3．反应缓冲液

取10 ml甘油、648 mg抗坏血酸纳（C₆ H ₇ O₆ Na·H ₂ O）、20．2 mg ACC和2．78 mg FeSO₄·7H ₂ O，溶解到0．1 mol/L、p H 7．5 Tris－盐酸缓冲液中，并定容至100 ml，即为反应缓冲液［含10%甘油（体积分数）、30 mmol/L抗坏血酸钠、2．0 mmol/L ACC和0．1 mmol/L FeSO₄］。

三、实验步骤(www.xing528.com)

（一）酶液提取

取3．0 g左右果肉，加入4．0 ml提取缓冲液，在冰浴条件下研磨匀浆后于4℃、12 000 r/min离心30 min。收集上清液即为酶提取液。

（二）酶活性测定

取0．5 ml酶提取液和1．5 ml反应缓冲被，加入到20 ml样品瓶中，用橡胶塞密封样品瓶后，向样品瓶中注射进1．0 ml纯CO₂气体，在30℃水浴中保温30 min。然后，顶空抽取1．0 ml气体测定乙烯释放量。

四、实验结果与计算

根据气相色谱法测得顶空气体中乙烯含量，以乙烯的产生速率表示每小时每克猕猴桃样品组织（鲜重）中ACC氧化酶活性，即为nmol/（h·g）。

ACC氧化酶活性＝（c×V _L×V）/（V _s×t×m×22．4）［nmol/（h·g）］

式中c——气谱法测得样品气体中乙烯含量（μl/L）；

　　　V _L——样品瓶剩余空间体积（ml）；

　　　V——样品提取液总体积（ml）；

　　　V _s——测定时所取样品提取液体积（ml）；

　　　t——酶促反应保温时间（h）；

　　　m——样品质量（g）；

22．4——标准状况下1 mol气体体积常数（L/mol）。