超氧阴离子产生速率的测定

实验3－8　超氧阴离子产生速率的测定

一、基本原理

超氧阴离子能与羟胺反应，生成能与对氨基苯磺酸和a－萘胺反应生成粉红色的偶氮染料，该染料在波长530 nm处具有显著光吸收。因此，利用羟胺氧化的方法可以测定猕猴桃组织中超氧阴离子的产生速率。与羟胺的反应式如下：

可用NaNO₂制作标准曲线，以浓度乘以2作为浓度，计算样品中产生速率。

二、仪器及试剂

（一）仪器及用具

研钵、高速冷冻离心机、移液器、离心管、试管、水浴锅、容量瓶（100 ml、1000 ml）、分光光度计。

（二）试剂

1．50 mmol/L、p H 7．8磷酸钠缓冲液

2．提取缓冲液（含1 mmol/LEDT A，1% Triton X－100和5% PVP）

称取37．2 mg EDT A、5 g PVP，取1 ml Triton X－100，加入到100 mmol/L、p H 7．0磷酸缓冲液中，溶解定容至100 ml，混匀。

3．1 mmol/L盐酸羟胺溶液

称取7．0 mg盐酸羟胺，用蒸馏水溶解，定容至100 ml。

4．17 mmol/L对氨基苯磺酸溶液

称取294．4 mg对氨基苯磺酸，用冰醋酸—水（3∶1，体积分数）溶解，并定容至100 ml。

5．7 mmol/L a－萘胺溶液

称取100．2 mg a－萘胺，用冰醋酸—水（3∶1，体积分数）溶解，并定容至100 ml。

6．100μmol/L NaNO₂标准液(www.xing528.com)

称取85．1 mg NaNO₂，用蒸馏水溶解、定容至100 ml，即为10 mmol/L NaNO₂溶液。取1．0 ml该溶液，稀释至100 ml，即为100μmol/L NaNO₂标准液。根据与羟胺的反应式，可计算得此溶液相当于200μmol/L溶液。

三、实验步骤

（一）制作标准曲线

取7支试管，编号，按照表12分别加入各种试剂，摇匀。在30℃保温30 min。取出后分别加入1．0 ml 17 mmol/L对氨基苯磺酸溶液和1．0 ml 7 mmol/L a－萘胺溶液，混匀后再于25℃保温20 min进行显色反应。以0号管为参比空白进行调零，立即测定显色液在波长530 nm处吸光度值。以吸光度值为纵坐标、浓度为横坐标，制作标准曲线。

表12　绘制NaNO₂，标准曲线各试剂加入量

（二）提取

称取3．0 g猕猴桃样品，加入5．0 ml提取缓冲液，在冰浴条件下研磨匀浆，于12 000 r/min、4℃离心20 min，收集上清液进行测定。

（三）测定

取1．0 ml上清液，加入1．0 ml 50 mmol/L、p H 7．8磷酸缓冲液和1．0 ml 1 mmol/L的盐酸羟胺溶液，摇匀后于25℃保温20 min。取出后加入1．0 ml 17 mmol/L对氨基苯磺酸溶液和1．0 ml 7 mmol/L a－萘胺溶液，混匀后于30℃保温30 min进行显色反应。按照与制作标准曲线相同的方法立即测定显色液在波长530 nm处吸光度值。

标准曲线1号管调零，重复三次。

四、实验结果与计算

根据样品管显色液与对照管显色液吸光度值的差值，从标准曲线上查出相应的浓度，并换算成的浓度（X），按下式含量计算公式：

含量（μg/g）＝（X×V×2）/（V s×m）

式中：n——由标准曲线查得的溶液中的浓度；

　　　V——样品提取液总体积（ml）；

　　　V _s——吸取样品液体积（ml）；

　　　m——样品质量（g）。