灰链霉菌链霉素生物活性测定

一、任务介绍

在模拟仿真生产环境下完成灰色链霉菌发酵生产链霉素的产物的检测。要求：

1.正确地对发酵预处理，能进行抗生素抑菌实验。

2.了解抗生素的检测和鉴定方法。

二、任务分析

（一）链霉素效价测定

一个链霉素效价单位为能抑制1ml肉汤培养基中大肠杆菌发育所需要的最小剂量。

抗生素的生物效价方法常用的有：稀释法、比浊法和扩散法（或称渗透法）。

1.稀释法　将抗生素稀释为各种浓度，并依次分装到一系列的容器内，再加入等量“试验菌种”菌液，放在37℃保温箱内孵育一定时间，观察何种稀释浓度能抑制细菌的生长，或以细菌生长所导致的pH改变及溶血现象等生化反应作为测定重点，再将同样处理的标准抗生素终点作比较，即可求得检品的效价。

2.比浊法　比浊法不以细菌有无生长作为区分终点，而是将标准品浓度和细菌生长所致混浊度求得一定的比例，再由检品的细菌生长浑浊度推算检品的效价。这一方法易受杂质的影响，并且不适用于有色或浑浊的检品。

3.扩散法　使用固体培养基，在培养基凝固以前将“试验菌种”混合进去，在这样备好的培养基表面，可以用种种设计使检品液或含有抗生素的物质与有菌种的培养基接触，经过培育后，由于抗生素向培养基中扩散，凡抑菌浓度所达、细菌不能生长而呈透明的抑菌范围，一般都呈圆形，成为“抑菌圈”。

本次实验采用“抑菌圈”法测定发酵液中链霉素的效价。

（二）抗生素的检测和鉴定方法

纸层析是鉴别抗生素的方法之一，常用8个溶剂系统进行纸层析，层析后进行生物显色并绘制层析图谱，根据层析图谱对未知抗生素进行鉴定。本实验采用其中一个溶剂系统，并用标准链霉素溶液作为对照对发酵液进行鉴定。

三、相关知识

产物的分析方法：

（1）还原糖的测定：DNS比色法。

（2）菌体浓度：培养液稀释到一定倍数后，采用分光光度计测定660nm下的吸光值。

四、任务需要的材料

大肠杆菌E.coli　K12S（用于生物显影）；金黄色葡萄球菌（Staphylococcus　aureus，用于生物显影）；牛津杯；正丁醇；新华3号滤纸；层析缸（30cm×10cm）；搪瓷盘（25cm×15cm× 5cm）；毛细管；培养皿。

1.链霉素标准溶液（10mg/ml）　将链霉素溶于去离子水中，无菌滤膜过滤后备用；

2.展层溶剂系统　水饱和的正丁醇。

五、任务实施

（一）操作前准备

1.操作人员按《生产区人员更衣规程》进行更衣。

2.检查发酵工作操作间是否有清场合格标志，并在有效期内。否则按清场标准操作规程进行清场并经QA人员检查合格后，填写清场合格证，才能进行下一步操作。将“清场合格证”附入批生产记录。

3.检查设备是否有“合格”、“已清洁”标牌，并对设备进行检查，确认设备正常，方可使用。

4.根据“批生产指令”填写领料单，到菌种部储领取菌种。

5.挂运行状态标志，进入操作。

（二）生产操作：(www.xing528.com)

1.链霉素效价测定　本实验采用扩散法对发酵液抗菌活性测定。

（1）制备牛肉膏蛋白胨固体培养基平板：向平皿内倒入约15ml牛肉膏蛋白胨固体培养基，平放待凝。

牛肉膏蛋白胨固体培养基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl　5g，琼脂20g，水1000ml，pH7.4～7.6，121℃高压蒸汽灭菌30分钟。

（2）均匀涂布大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的混合菌液：在凝固的牛肉膏蛋白胨固体培养基平板上均匀涂布大肠杆菌。

（3）在凝固的平板上放置牛津杯，待其表面干燥后，用镊子分别取3～4个灭菌的牛津杯，垂直置于已凝固的平板上。

（4）牛津杯注入发酵液，培养过夜：取上述发酵液0.2ml注入3个牛津杯中，取无菌水0.2ml注入另一个牛津杯中作为阴性对照，稳端平板放在37℃培养箱中培养过夜。

（5）观察结果：牛津杯周围有无抑菌圈、测量记录抑菌圈大小。

2.链霉素的纸层析鉴定

（1）点样：在距新华滤纸（25cm×19cm）底端2.5cm处划一道横线，用毛细管将发酵清液和标准链霉素溶液（10mg/ml）点在滤纸的横线上。每个样品之间距离2cm。

（2）层析：将点好样的滤纸做成圆筒状，置于含有展层溶剂系统的层析缸中，于20～25℃上行扩展20～25cm后取出，挥发除净溶剂。

（3）显影（生物显影法）：将滤纸贴在接种有大肠杆菌或金黄色葡萄球菌的琼脂平板上，置冰箱中（10℃，4小时），使滤纸上的抗生素渗透到平板上，然后于30～35℃培养16～20小时，根据平板上样品抑菌区的位置判断抗生素的类型。

（三）生产结束

1.按《检测车间清场操作规程》对设备、房间进行清洁消毒。

2.填写清场记录，经QA检查员检查合格，在批生产记录上签字，并签发“清场合格证”。

（四）标准操作规程

1.产物检测岗位标准操作规程。

2.产物检测间清场操作规程。

六、归纳总结

（一）生产工艺管理要点

1.能按照GMP规范组织生产，协调各工序的工作组织生产、质量控制。

2.观察链霉素发酵液对细菌的抑制作用。

3.抗生素的生物效价如何衡量。

（二）质量控制关键点

能进行与本车间相关的质量要点控制。

七、拓展提高

1.能对本产品生产过程中的较重大的事故隐患提出处理意见，并采取有效措施减少对生产的影响。

2.具有应对事故的处理能力。

3.能起草标准操作规程

（宋小平）