一、任务介绍
在模拟仿真生产环境下完成培养基的配制、灭菌和种子的制备工作。要求：
1.能合理选用和制备灰色链霉菌生长所用的培养基。
2.按照培养基配制的标准操作规程制备培养基。
3.能安全操作高压灭菌锅，并进行日常维护。
4.按照标准操作规程，正确使用培养基制备中常用的仪器，如天平、加热设备、pH计等。
5.熟悉发酵工业菌种的复壮工艺和质量控制。
6.按照超净工作台操作规程，在局部洁净区进行灰色链霉菌菌种的制备。
二、任务分析
发酵准备包括培养基的配制、灭菌和种子的制备工作。灰色链霉菌生长缓慢，所以培养基的营养成分必须含有碳源、氮源、能源、无机盐、生长因子和水，其中培养基中的碳源和氮源常采用迅速和缓慢利用的混合碳源、混合氮源。磷酸盐在调节抗生素生物合成中作用明显，一方面直接影响抗生素生物合成中的磷酸酯酶和前体形成中某种酶的活性；另一方面间接调节胞内其他效应剂（如ATP和cAMP），进而影响抗生素合成，所以磷酸盐的量要适宜。
灰色链霉菌的孢子发芽缓慢，所以可以用液体培养法，即试管→平板→三角瓶→种子罐。在工业上，为了控制菌体的生长和产物的合成，发酵培养基中宜采用迅速和缓慢利用的混合碳源、混合氮源。
发酵准备一般要经过操作前准备、生产操作和准备结束的清洁清场。
三、相关知识
培养基的营养成分及功能、类型和用途，培养基的选择和确定；培养基灭菌的方法。
固体接种和液体接种法。
四、任务需要的材料
1.菌种 灰色链霉菌Streptomyces griseus AS 4.1095（链霉素产生菌，中国菌种保藏中心）。
2.试剂和器材 葡萄糖；蛋白胨；黄豆饼粉；淀粉；CaCO3；（NH4）2SO4；三角瓶（50ml，100ml，250ml，500ml）；培养皿；恒温摇床；冷冻离心机；高压灭菌锅；超净工作台等。
附：培养基的配方：
（1）孢子固体培养基（1L）：黄豆饼粉22.3g，葡萄糖24.3g，蛋白胨1.33g，pH7.2～7.4，115℃高压蒸汽灭菌30分钟；28℃，恒温培养6～7天。
（2）液体种子培养基（1L）：黄豆饼粉22.3g，葡萄糖24.3g，淀粉18.7g，（NH4）2SO42g，蛋白胨1.33g，pH7.2～7.4，115℃高压蒸汽灭菌30分钟；28℃，200转/分振荡培养4～5天，即成母瓶培养液。
（3）发酵培养基（1L）：黄豆饼粉22.3g，葡萄糖10g，NaCl 2.5g，蛋白胨1g，淀粉18.7g，（NH4）2SO42g，CaCO32g，pH 7.2，115℃高压蒸汽灭菌30分钟。
五、任务实施
（一）操作前准备
1.按《进入生产区更衣程序》，培养基制备操作人员进出洁净区人员更衣规程进行更衣。
2.检查操作间是否有清场合格标志，并在有效期内。否则按清场标准操作规程进行清场并经QA人员检查合格后，填写清场合格证，才能进行下一步操作。将“清场合格证”附入批生产记录。
3.检查设备是否有“合格”、“已清洁”标牌，并对设备进行检查，确认设备正常，方可使用。
4.挂运行状态标志，进入操作。
（二）生产操作
1.培养基的制备和灭菌。按照配方配制孢子培养基和种子培养基，115℃高压蒸汽灭菌30分钟。
2.种子制备(www.xing528.com)
（1）固体孢子的制备：用接种环（接种铲）挑取冰箱中保藏的菌种接种于种子斜面培养基（或平板培养基）上，于28℃恒温培养箱中培养6～7天，即可得到孢子。
（2）母瓶培养液的制备：向斜面菌种或平板中加入约3ml无菌水，用接种铲铲下斜面上的孢子制备孢子悬液。将孢子悬液接入含有20ml黄豆饼粉种子液体培养基的三角瓶中，28℃，200转/分，振荡培养4～5天。（或者：从斜面培养基表面上，用无菌镊子撕下一块含有孢子的培养基，接种于灭菌的含有20ml黄豆饼粉种子液体培养基的三角瓶中，28℃，200转/分，振荡培养4～5天，即成母瓶培养液。
备注：在液体培养基中，链霉菌生长的的菌丝难以用吸管吸，故在接发酵培养基时，只能倒入其中，所以每瓶种子培养基的量要计算好。
（3）种子培养液的制备：无菌操作取2ml母瓶培养液接种于含有100ml发酵培养基的三角瓶中，于27℃恒温摇床，200转/分，培养3～4天。
（三）生产结束
1.按《称量间清场操作规程》和《配制间清场操作规程》对仪器、房间进行清洁消毒。
2.填写批生产记录，并签字。
3.填写清场记录，经QA检查员检查合格，并签发“清场合格证”。
（四）标准操作规程
1.培养基配制岗位标准操作规程。
2.pH计操作、维护规程。
3.高压蒸汽灭菌锅标准操作规程。
4.电子天平操作程序规程。
5.称量间清场操作规程。
6.配制间清场操作规程。
7.菌种岗位标准操作规程。
8.超净工作台标准操作规程。
9.菌种间清场操作规程。
六、任务归纳总结
（一）生产工艺管理要点
1.称量间、配制间保持GMP要求的洁净度级别。
2.正确配制培养基。
3.菌种操作室洁净度按万级洁净度要求，操作区洁净度达百级。
4.接种后放置生化培养箱或摇床培养。
5.接种过程应确保严格的无菌操作。
（二）质量控制关键点
1.培养基的无菌检查合格。
2.制备的种子为纯种 ①斜面孢子（固体孢子）的生长情况；②液体种子的生长情况。
七、任务的拓展提高
设备常见故障及排除。
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