淋巴细胞亚群的分离方法及鉴定技术

知识目标

掌握密度法分离淋巴细胞的原理

掌握检测淋巴细胞表面标志的方法

课前思考：

如何能测定血液中有多少淋巴细胞？

如何区别不同的淋巴细胞？

如何鉴定T、B淋巴细胞及其亚型？

教学内容：

淋巴细胞的分离鉴定

（一）外周血单个核细胞的分离

体外检测淋巴细胞，首先需制备外周血单个核细胞（PBMC），常用的方法是葡聚糖-泛影葡胺（又称淋巴细胞分离液）密度梯度离心法。红细胞和多形核白细胞的比重（约1.092）大于单个核细胞（约1.075），将抗凝血叠加于比重为1.077的分离液液面上，可通过低速离心将不同比重的细胞分层：红细胞沉于管底；多形核白细胞密集布于红细胞层与分离液之间；血小板悬浮于血浆中；单个核细胞则密集于血浆层与分离液界面。该法分离淋巴细胞的纯度可达95%。若需进一步纯化淋巴细胞，可将单个核细胞铺于培养皿上，由于单核细胞易与玻璃黏附而滞留于平皿表面，未吸附的细胞即主要是淋巴细胞。

（二）淋巴细胞亚群的分离

淋巴细胞为不均一的群体，可借助其表面标志及功能差异而分为不同的群和亚群。

1、尼龙棉分离法

将淋巴细胞悬液通过尼龙棉柱，B细胞易与尼龙棉黏附而滞留于柱上，T细胞则不黏附，借此可分离T细胞与B细胞。

2、E花结分离法

人成熟T细胞表面具有绵羊红细胞（SRBC）受体，能结合SRBC而形成花结（E花结试验），经密度梯度离心，花结形成细胞因比重增大而沉于管底，与其他细胞分离；用低渗法裂解花结中的SRBC，即获得纯化的T细胞。

3、洗淘法

将已知抗特定细胞表面标志的抗体包被聚苯乙烯培养板，加入淋巴细胞悬液，表达相应表面标志的细胞即结合于培养板表面，与悬液中的其他细胞分离。

4、流式细胞术(flow cytometry，FCM) 

借助荧光活化细胞分类仪(fluorescence-activated cell sorter，FACS)对细胞快速鉴定和分类、并进行多参数定量测定和综合分析的技术。样品与经多种荧光素标记的抗体反应，因荧光素发射光谱的波长不同，信号能同时被接收，故能同时分析细胞表面多个膜分子表达及其水平。该法可检测各类免疫细胞、细胞亚类及其比率。此外，借助光电效应，微滴通过电场时出现不同偏向，可分类收集所需细胞。

5、磁分离技术

将特异性抗体与磁性微粒交联，称为免疫磁珠（immune m抗原netic bead，IMB）。IMB可与表达相应膜抗原的细胞结合，应用强磁场分离IMB及其所吸附的细胞，从而对特定的细胞进行分选，此为直接分离法。亦可用二抗包被磁性微珠，与任何已结合鼠源性一抗的细胞进行反应，从而分离细胞，此为间接分离法。

（三）T细胞及其亚群的鉴定和检测(www.xing528.com)

1、E玫瑰花环形成试验

可用于人T细胞的鉴定和检测。绵羊红细胞和人外周血淋巴细胞在4℃孕育1-2h，检测花环样细胞集团数量。正常人外周血中E玫瑰花环形成细胞占淋巴细胞总数的60%-80%。

2、T细胞单克隆抗体对T细胞及其亚群的鉴定和检测

   所用的抗体主要有：CD₃McAb、CD₄ McAb和CD₈ McAb。

方法：免疫荧光间接法。

   外周血淋巴细胞，分别用小鼠抗人CD₃、CD₄、CD₈ McAb （第一抗体）加荧光素标记的兔抗小鼠IgG抗体（第二抗体），在荧光显微镜下观察结合有荧光素标记抗体的细胞，亦可应用FCM自动计数荧光阳性细胞百分率。

结果：

 （1）被CD₃ McAb着染荧光的细胞是总T细胞，包括：Th、Th1、Th2、Tc、Ts细胞。

 （2）被CD₄ McAb着染荧光的细胞是Th、Th1、Th2细胞。

 （3）被CD₈ McAb着染荧光的细胞是Tc、Ts细胞。

计数：

    100-200个淋巴细胞，计算出染阳性细胞百分率：

    CD₃^＋T细胞占65%-80%。CD₄T细胞占50-60%。

    CD₈^＋T细胞占20%-30%，

    CD₄^＋T细胞与CD8T细胞比值约为2：1。

（四）B细胞鉴定和检测

mIgM/D是B细胞表面特有的标志，通过对该种标志的检测，可对B细胞进行鉴定和检测。

方法：免疫荧光直接法。

荧光素标记的兔抗人IgM/D抗体加外周血淋巴细胞，直接免疫荧光染色、观察。着染荧光的细胞为B细胞，占淋巴细胞总数的8%-12%。

淋巴细胞的分离、鉴定还有哪些方法？各有何优缺点？

1、写出密度法分离淋巴细胞的原理、步骤

2、设计一个方案来鉴定TH淋巴细胞