现代农业技术在药用植物生产中的应用

①植物细胞培养时，其生长速度较慢，通常完成一次生产周期需4~5周才能完成；而微生物的工业发酵只需几天就可完成发酵全过程。

②植物细胞培养生产次生代谢物的总量一般比植物本身低，这主要是由于大多数离体培养细胞不能合成和积累所期望的化合物，当然也有些细胞株系产量高，这与微生物大不相同。

③生产技术上还存在一些问题。培养过程需要复杂的培养基及附加物，且易受细菌、真菌的污染；次生物的产量不甚稳定，成本较高等。

（一）微生物类

1.冬虫夏草、灵芝——真菌

摇瓶培养中菌粉的产率达到1.5% 以上。人工培养冬虫夏草菌丝体的功用已得到普遍认可，目前产品售价大约2000元／kg左右。  

2.内生菌

内生菌：是指在其生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物的各种组织和器官的细胞间隙或细胞内，不引发宿主植物表现出明显感染症状的微生物。

应用：分离内生菌发酵生产天然药物

   （已有数十种）

一是内生菌自身产生药用植物活性成分。 

1993年美国蒙大拿州立大学的Strobel小组首次从短叶红豆杉中分离得到一株能合成抗癌物质紫杉醇的内生真菌 。

二是内生菌促进药用植物产生活性成分。

例如，江东福（2003）等发现，内生真菌对龙血树血竭形成具有很强的促进作用，可使血竭的形成量提高66%～120%。

1.利用发根农杆菌遗传转化获得毛状根生产次生代谢产物，发根农杆菌侵染药用植物可建立起“毛状根”培养系统。生长速度快，激素自养，分化程度高以及遗传性状相对稳定。

胡之壁等对黄芪毛状根的大规模培养，在3.5 L和10 L培养容器中都获得了毛状根，21d培养产量（干重）10g/L。

菘蓝和四倍体采用发根农根菌菌株A4，R1601，ATCC15834转化四倍体菘蓝的子叶，成功地诱导出毛状根，建立了离体毛状根培养系   

（1）细菌菌株——活化——振荡培养。

（2）四倍体菘蓝种子消毒——MS固体培养基萌发。    

（3）接种：将菘蓝子叶切成0.5 cm2的小块，浸入菌液共培养10 min，取出，置于MS固体培养基上培养每隔5 d转接1次。    

（4）毛状根离体培养和优良克隆选择：毛状根MS固体培养基上培养。选择生长快、分枝多的毛状根于MS液体培养基中振荡培养，两星期后收获毛状根。

丹参、长春花、烟草、紫草、人参、曼陀罗、颠茄、丹参、黄花、甘草和青蒿等四十多种植物中建立了毛状根培养系统。 

西南大学：长春花中长春碱和长春新碱是目前应用最广泛的天然抗癌药物。但含量极其微小，仅为百万分之几至十万分之几，化学合成和半合成也不太理想，因此来源困难，价格十分昂贵，长春碱全世界每年只能生产12公斤，长春新碱每年只能生产1公斤,远远不能满足市场需求。通过建立毛状根大量培植系统和植株再生系统,可以直接从毛状根和再生植株中获得高而稳定的抗癌生物碱。经过选择和离体培养,获得了三个生长迅速、生物碱含量比原植物体高35到57倍的毛状根优良无性系。

2.细胞培养

1968年日本明治制药公司在古谷等人的指导下，用1.3×105L的培养罐开始进行人参细胞培养的工业化生产，从而使植物细胞发酵罐培养进入了工厂化生产的实用阶段。

中科院植物所的科研人员在新疆紫草的细胞培养中获得了成功，使紫草中主要成分乙酰紫草素的含量提高4.7倍。

             自然植物和细胞培养的紫草宁含量比较

生产方式           生产周期            紫草宁含量（％干重）

完整植物           2～3年                   1～2

植物细胞培养         3周                    14

　             　植物次生代谢产品的市场潜能

产品成分　　              用途　　           年销售额（亿美元）

长春花碱　              治疗白血病　          18～20（美国）

奎宁　　               　治疗疟疾　　　        5～10（美国）

致热素　　               杀虫剂　　　　        20（全世界）

毛地黄　　               心脏病药　　　        20-55（美国）

（一）植物细胞规模化培养体系的建立

（二）利用细胞培养生产有用物质 

1.选材

2.细胞株系建立—单细胞培养

3.大量培养---悬浮培养—生物反应器

4.产品提取与纯化

（一）植物细胞大规模培养的技术要求

从工程的角度讲必须要进一步研究和开发适宜于植物细胞生长和次生代谢产物生产的生物反应器，建立最佳的控制和调节系统。

从细胞生长与培养技术方面讲必须满足以下3个条件：

1.培养的细胞在遗传上应是稳定的，以得到产量恒定的产物。

2.细胞生长及生物合成的速度快，在较短的时间内能得到较高产量的终产物。

3.代谢产物要在细胞中积累而不被迅速分解，最好能将其释放到培养基中。

（二）植物细胞规模化培养体系的建立

1.种子细胞的选择

（1）准确选择能产生目的化合物的植物种类；

（2）尽量选择自然状态下产生天然产物的组织器官为外植体；

（3）高产种子细胞克隆的方法：单细胞培养后，将单细胞扩增形成的愈伤组织分2份，1份成分含量分析，另1份保留培养。

2.种子细胞系的增殖与放大培养

种子细胞增殖初期一般采用摇瓶培养，摇瓶体积从几百毫升到几升逐级放大。当细胞数量增加到一定值后，应转移至体积较小的生物反应器培养。

3.大规模培养体系的建立

（1）成批培养：在一个培养体积中接种细胞或添加培养基后，中途不添加也不更换培养基的方式。

（2）连续培养：在培养过程中，不断向反应器中以一定流量添加新培养基，同时以一定流量从系统中取出培养基的方式。

（3）半连续培养：在完成成批培养的一个周期后，从反应器中取出大部分细胞悬液，只保留小部分细胞悬液作为下一培养周期的种子细胞，然后加入新鲜培养基进行培养的方式。

（三）生物反应器类型及特点

大规模培养系统基本原理方法与上述实验室悬浮培养一致，但大规模培养所采用的设备及控制技术比实验室小规模培养要复杂的多。 

要求：植物细胞培养具有周期长、细胞抗剪切能力弱、易团聚等特点。同时，植物细胞规模培养的目的是生产天然产物，所以，植物细胞培养反应器的设计不仅要考虑有利于细胞生长，还要考虑有利于产物的积累和分离。

总体上，适合植物细胞培养的反应器应具有适宜的氧传递、良好的流动性和较低的剪切力。

1.机械搅拌式培养系统

机械搅拌式生物反应器通常是在微生物发酵罐的基础上改进设计的，根据植物细胞的特性，其设备要求在微生物发酵罐的基础上作如下改进：搅拌装置要减少剪切，一般改叶轮式为螺旋式；因为植物细胞生长周期长，需要随时补充水分和营养，因此必须设计加液装置；由于植物细胞的生理活动需要新鲜空气，且细胞代谢也可能产生有害气体，所以必须设计通气装置； 为便于取样观察，一般还设计有取样口。 

生物反应器

Stirred Tank Bioreactors(www.xing528.com)

An external motor is used to agitate the growth medium with impellers.

Sterile air or combinations of gases can be introduced 

(sparkling)

2.气压搅拌式培养系统

考虑到机械搅拌式反应器的剪切作用难以避免，同时搅拌器转动的中轴往往是容易使培养物污染的部位，因此，发展出空气提升式生物反应器，但其缺点是搅拌不均匀。 

Bubble Column Bioreactor (Airlift Reactor)

Introduction of sterile air or pure gases 

is used both for agitation and oxygenation

Internal Loop Airlift Bioreactor

Tube placed 

inside the reactor 

creates 

internal 

circulation loop 

External aLoop Airlift Bioreactor

Circulation 

through an 

external loop 

3.旋转式培养系统

一般用于产品中试或某些必需裂解细胞才能获得目的产物的培养，其优点是控制精确，处理灵活，缺点是培养体积较小。 

4.固定化培养系统

这一技术的优点在于：

可以较容易地控制培养系统的理化环境，从而可以研究特定的代谢途径，并便于调节；

细胞位置的固定使其所处的环境类似于在植物体中所处的状态，相互间接触密切，可以形成一定的理化梯度，有利于次生产物的合成；

由于细胞固定在支持物上，培养基可以不断更换，可以从培养基中提取产物，免除了培养基中因含有过多的初生产物对细胞代谢的反馈抑制，也由于细胞留在反应器中，新的培养基可以再次利用这些细胞生产初生产物，从而节省了生产细胞所付出的时间和费用；

正是由于细胞固定在一定的介质中，并可以从培养基中不断提取产物，因此，它可以进行连续生产。

细胞固定化培养技术按照其支持物不同可以分为两大类：

包埋式固定化培养系统：支持物多采用琼脂、琼脂糖、藻酸盐、聚丙烯酰胺等；

附着式固定化培养系统：支持物采用尼龙网、聚氨酯泡沫、中空纤维等材料。 

（四）利用细胞培养生产有用物质

1.利用细胞培养生产有用物质的一般程序

（1）选材　应注意以下条件：

①药效肯定；

②对其有效成分有充分的了解；

③有测定有效成分和药理的可靠方法； 

④市场短缺或价格昂贵；　

⑤取有药效成分的部位，且该部位较易形成愈伤组织。

（2）细胞株系建立

将诱导产生的愈伤组织进行分离，建立悬浮细胞繁殖体系（液体培养）。 

在工厂化生产中，为了提高有用物质产品的产量和质量，对细胞培养的选择有两个基本要求： 

①有用物质的合成积累能力强 

②生长速度快 

（3）大量培养

将选出的优良细胞株扩大繁殖后，可作为细胞工厂化培养的生产“种子”，进行大量培养。 

（1）成批培养：在一个培养体积中接种细胞或添加培养基后，中途不添加也不更换培养基的方式。

（2）连续培养：在培养过程中，不断向反应器中以一定流量添加新培养基，同时以一定流量从系统中取出培养基的方式。

（3）半连续培养：在完成成批培养的一个周期后，从反应器中取出大部分细胞悬液，只保留小部分细胞悬液作为下一培养周期的种子细胞，然后加入新鲜培养基进行培养的方式。

（4）产品提取与纯化

从植物细胞培养物中提取和纯化有的产品。

2.提高有用物质生产效率的技术因素

①筛选高产细胞系

从实验材料中筛选高产的细胞株系是提高生产率、降低生产成本的重要因素。特异的次生代谢产物往往是特异的器官中形成的。因此，用特异器官为材料，建立特异功能的细胞系，并从中反复多代培养选择有效的、高产的细胞株。

筛选出的高效、高产细胞株系，有的植物细胞系其高效、高产性能稳定多年，但有的植物细胞系不稳定，因此，还需要定期检测，更新细胞株系。

②二步培养法

第一步：解决生物量生产（促进细胞分裂）； 

第二步：促进次生代谢物合成，即在细胞指数生长停止期前后才更换培养基，有利于次生物质的积累。

③培养基中添加前体

前体：有用次生代谢物的前驱物。

烟草愈伤组织培养中，将前体物质—烟碱酸加入，会增加烟碱的生成量。

④培养基中生长调节剂的作用 

植物生长调节剂不仅影响植物的脱分化与再分化，而且能影响次生代谢物质的产生。如烟草愈伤组织培养中，培养基中添加IAA，能合成烟碱，而在含有2,4-D的培养基上，烟碱合成受阻。 

⑤培养条件的影响

光照、温度等影响次生代谢。在胡萝卜愈伤组织培养中，光照条件使紫红色愈伤组织能够生成大量的花箐苷，并且低温条件下，生成量高。 

⑥采用固相细胞培养系统

细胞生长分裂旺盛时，次生代谢物产量低。采用固相培养，将细胞培养在惰性基质中，细胞生长缓慢，可提高次生代谢物质的产量。