药物基因组学专用基因芯片平台

目前，许多生物科技公司已经开始为用户提供商业化的基因分型服务。如Clingenix Inc，Epidauros Biotechnologie AG，Clinical Data Inc，LGC Ltd等，都能提供以直接测序为基础的基因分型服务。而像Illumina Inc，Applied Biosystems 和 SEQUENOM Inc等公司则能提供全基因组SNP检测平台或定制SNP检测平台。此外，还有一些公司则专门提供针对某一些药物相关遗传变异的检测工具，如由Third Wave Technologies Inc开发的针对UGT1A1多态性的检测平台，由Nanosphere Inc，PharagonDx LLC，AutoGenomics Inc 和Luminex Corp共同开发的CYP2C9和VKORC1的检测平台，由Roche Diagnostics Corp开发的CYP2D6和CYP2C19检测平台（AmpliChipP450）等。在众多的检测平台中，由Affymetrix Inc 开发的DMET plus芯片平台着重关注了与药物吸收、分布、代谢和消除（ADME）相关的225个基因和1 936个遗传变异。同时配合其数据分析软件，DMET plus芯片平台是目前药物基因组学研究最有力的基因分析工具。在这节中我们将对其进行详细的介绍和分析。

一、简　介

最初的Affymetrix DMET芯片命名为DMET 1.0，分析包括1 243个遗传变异在内的169个涉及药物分布的基因，49个CYP家族基因，73个非CYP家族基因和47个转运体基因。这些基因的选择主要来自科学文献以及临床药理学专家的建议。对遗传变异的选择除来自科学文献外，还来自NCBI的dbSNP数据库，EBI数据库，Ensembl数据库以及CYPallele数据库。随着药物基因组学研究的不断发展，以及检测拷贝数变异（CNVs）技术的成熟，新的遗传变异被加入进来，一些不重要的变异被去除，并于2008年11月发布了新的DMET芯片平台，命名为DMET plus。新的DMET平台可检测225个基因中的1 936个遗传变异（包括5个CNVs：CYP2D6、CYP2A6、GSTT1、GSTM1、UGT2B17以及CYP2D6中的一个缺失突变）。这些基因包括47个Ⅰ相CYP代谢酶，70个Ⅱ相代谢酶，62个转运体基因以及46个其他涉及药物分布的基因。DMET plus对遗传变异的检测主要基于倒置型分子探针技术（Molecular inversion probe，MIP）。MIP技术是从鞍型探针技术（podlock probes）改进而来，适用于高通量的SNPs分析。对于MIP的设计方法以及DMET plus芯片的具体实验流程可参考Affymetrix DMET plus网页上提供的用户操作手册（http：//www. affymetrix.com/products_services/arrays/specifi c/dmet.affx）以及一些方法学文献。

二、DMET plus数据生成及分析基本流程

如图3-3所示，在完成芯片扫描前准备工作（参考用户手册）后，Affymetix DMET plus数据生成及分析流程基本上分为3大步骤，并由不同的软件来控制和实现。第一步为获得样本信息，包括样本的基本识别信息以及所对应芯片的识别信息等。通过DMET plus芯片控制中心（affymetrix genechip command console，AGCC）可完成这些信息的收集，并生成样本信息文件（ARR文件）。芯片扫描结束后，AGCC还将生产样本的集成数据文件（CEL文件）。这两个文件所包含的样本识别信息和样本基因型信息将在下一步由DMET数据中心（DMET console）来解析。第二步为初步数据分析，通过DMET数据中心来完成3项主要任务：①样本质量控制；②基因型数据分析，并生成基因型数据文件（CHP文件）；③将基因型数据翻译成相对应的单体型数据。DMET数据中心默认的各样本的变异检出率（call rate）为99%，低于这个的阈值的样本将被归入不合格类（out of bound）。但研究人员仍能根据各个变异在所有样本中的检出率来判断各个变异的检出结果是否可靠。这两个检出率为研究人员提供了有效的质量控制手段。通过解析CEL文件，DMET数据中心可生成包含各样本基因型数据的CHP文件。根据研究人员自定义的变异列表（marker list），可以从CHP文件中将特定的基因型信息或者全部基因型信息导出成表格文件，以供后续分析使用。导出格式分为两种，一种为所有基因型×所有样本编号（collate result），另一种为整合显示各样本的所有基因型（included extended results）。根据不同研究需要，可灵活选择。将基因型数据翻译为对应的单体型数据，是DMET数据中心的一大特色。在此之前，尚没有任何基因分型方法和软件能比较高效的完成这一任务。在DMET芯片所分析的225个基因中，有60个基因的基因型数据可以被翻译成对应的单体型数据（表3-5），此外这些单体型对基因功能的改变也被一并标示，供研究人员参考。这就为药物基因组学研究提供了更为丰富和有力的数据支持。第三步则为二级和三级数据分析。当个体的基因型或单体型数据被导出DMET数据中心后，研究人员可使用不同的数据分析软件来实现不同的研究目的。例如，使用Cluster 3.0/TreeView来完成聚类分析，使用R来完成主成分分析（principle component analysis，PCA）等。目前已有一些研究者在使用DMET芯片进行一些药物基因组学研究。例如，Mega等人使用DMET 1.0芯片在冠心病患者中研究了P450酶多态性对氯吡格雷药动学和药效学的影响，其研究结果发表在了新英格兰杂志上。

表3-5　拥有单体型数据支持的DMET基因

图3-3　DMET pIus数据生成及分析流程

三、应用DMET plus芯片的障碍

目前，Affymetrix DMET plus芯片检测平台包含了大量与药物分布、代谢、转运和消除相关的基因。这为将来的药物基因组学研究提供了强有力的技术支持。但其应用仍存在一些障碍。其中最重要的一点就是到目前为止，DMET检测平台尚未通过美国食品与药品管理局（FDA）的审批，因此还不能用于任何临床诊断过程。其应用仅局限于实验室研究的范畴之内。例如，首先，DMET平台不能用于检测患者的CYP2C9，CYP4F2，VKORC1或者UGT1A1基因，以指导华法林或者伊立替康的临床用药。其次，对于DMET芯片平台的操作需要相应的专业培训，各研究中心是否能独立开展基于DMET芯片技术的研究，并获得可靠的数据依然需要得到Affymetrix公司的支持。再次，每张芯片高达350美元的昂贵费用也是限制该项技术广泛应用的重要原因，这还不包括芯片扫描仪等硬件设备以及配套试剂耗材的费用。花费-效能比仍然是一个大多数研究者需要考虑的重要因素。

四、总　结

随着药物基因组学研究的不断发展，各种新型的基因分型技术不断涌现。从Roche AmpliChip CYP450 分析29个CYP2D6遗传变异和2个CYP2C19遗传变异，到Illumina VeraCode ADME Core Panel能分析34个药物相关基因的185个遗传变异，再到Affymetrix DMET plus能分析225个药物相关基因的1936个遗传变异，技术的进步为药物基因组学研究提供了更强有力的分析工具。但随之而来的海量数据，也给药物基因组学研究带来了重大挑战。随着基因芯片技术与生物信息学技术在药物基因组学研究中的不断融合、应用，个体化药物治疗已开始展示出其广阔的应用前景，并终将为所有患者带来福祉。

（贺毅憬　许林勇　张　伟）

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