退浆率测定结果，纤维素酶活力测定方法

附　录

附录一　退浆率的测定

一、失重法

以服装失重率来表示的退浆率，将退浆前后的织物分别在恒温恒湿箱（温度20℃，相对湿度65%）中平衡24h后称重，重量分别为m1和m2。退浆后织物失重率采用如下公式计算：

二、比色法

对于牛仔服装，浆料主要以淀粉为主，通过织物上淀粉浆料去除率的测定可衡量退浆率的高低。

1．试剂

（1）420g／L高氯酸溶液：取70%高氯酸溶液300g定容至500mL，即得420g／L溶液。

（2）酚酞试剂：取0．5g酚酞，用95%乙醇溶解并稀释至100mL。

（3）6mol／L氢氧化钠溶液：取60g固体氢氧化钠定容至250mL容量瓶中，即得6mol／L溶液。

（4）2mol／L醋酸溶液：取60g醋酸定容至500mL，即得2mol／L溶液。

（5）100g／L碘化钾溶液：取10g碘化钾定容至100mL，即得100g／L溶液。

（6）0．05mol／L碘酸钾溶液：取1．07g碘酸钾定容至100mL，即得0．05mol／L溶液。

2．实验步骤

分别取退浆前后棉织物各约2g（精确至0．0001g），将棉织物剪成5mm×5mm左右的小块，加入420g／L高氯酸溶液约30mL，室温下搅拌30min，加入100mL蒸馏水和酚酞指示剂2滴，加入6mol／L氢氧化钠溶液至织物溶液呈淡粉色，再滴加2mol／L醋酸溶液至淡粉色消失。过滤，将滤液转移至250mL的容量瓶中，用蒸馏水冲洗织物并抽滤两次，将冲洗液转移至容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度。

吸取该溶液5mL置于50mL容量瓶中，加入2mol／L醋酸溶液25mL、100g／L碘化钾溶液0．5mL、0．05mol／L碘酸钾溶液2mL，再用蒸馏水稀释至刻度，在避光处放置显色5min，以含2mol／L醋酸溶液25mL、100g／L碘化钾溶液0．5mL、0．05mol／L碘酸钾溶液2mL的空白退浆溶液作参比，在620nm处测定光密度值（B）。

3．退浆率的计算

式中：B1——退浆前织物处理液的光密度值；

B2——退浆后织物处理液的光密度值。

三、目测法

用淀粉—碘液显色法检测。在被测织物上滴一滴碘液，在1～2min后观察所呈现的色泽（以外圈色泽为准）。若色泽呈现蓝色，则表明含淀粉浆料，且色泽越深，浆料含量越多；若色泽呈现黄色，则表明不含淀粉浆料。

1．评级方法

观察被测织物滴碘液区呈现蓝色的深浅程度，未退浆布样呈现的深蓝色为1级，退浆干净布样呈现的淡黄色（无蓝色）为5级，最小单位为0．5级。级数越高，表示布样浆料退除得越干净。

2．碘液的配制

在0．25mol／L碘酸钾溶液100mL中，加入10%碘化钾溶液20mL、2mol／L醋酸溶液10mL及渗透剂JFC　1mL，混合均匀后移入棕色瓶中备用。

附录二　纤维素酶各组分活力的测定

一、测定原理

纤维素酶是一种多组分酶，包括C1酶（外切酶）、CX酶（内切酶）和β－葡萄糖苷酶三种主要组分。其中，C1酶的作用是将天然纤维素水解成无定形纤维素，CX酶的作用是将无定形纤维素继续水解成纤维寡糖，β－葡萄糖苷酶的作用是将纤维寡糖水解成葡萄糖。纤维素酶水解纤维素产生的纤维二糖、葡萄糖等还原糖能将碱性条件下的3，5－二硝基水杨酸（DNS）还原，生成棕红色的氨基化合物，在540nm波长处有最大光吸收。在一定范围内，还原糖的量与反应液的颜色强度呈比例关系，利用比色法测定其还原糖生成的量就可测定纤维素酶的活力。

滤纸酶活力指的是纤维素酶的总酶活力，它归功于C1酶、Cx酶及β－葡萄糖苷酶三者协同作用的结果，即C1酶首先作用于纤维素的结晶区，破坏纤维素的结晶结构，再由Cx酶深入内部将纤维素长链切割成短链的低聚糖，最后由β－葡萄糖苷酶将这些中间产物降解为葡萄糖。

二、实验材料、仪器和试剂

1．实验材料

（1）纤维素酶制剂，500mg。

（2）新华定量滤纸，规格50mg／份，4份。

（3）脱脂棉花，规格50mg／份，4份。

（4）羧甲基纤维素钠（CMC），510mg。

（5）水杨酸酐，500mg。

2．主要仪器

（1）722型或其他型号的可见分光光度计。

（2）恒温水浴锅2台，沸水浴锅1台。

（3）万分之一分析天平，1台。

（4）恒温干燥箱，1台。

（5）具塞刻度试管，20mL的24支。

（6）移液管或加液器，0．5mL的3支，2mL的7支。

（7）容量瓶，100mL的6支，1000mL的3支。

（8）量筒，50mL的2支，100mL的1支，500mL的1支。

（9）烧杯，100mL的6支，500mL的3支，1000mL的1支。

3．试剂(www.xing528.com)

（1）1mg／mL的标准葡萄糖溶液。将葡萄糖在恒温干燥箱中于105℃下干燥至恒重，准确称取100mg于100mL小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，移入100mL容量瓶中用蒸馏水定容至100mL，充分混合均匀。放置冰箱中，于4℃下保存备用（可用12～15天）。

（2）0．0276mol／L的3，5－二硝基水杨酸（DNS）溶液。准确称取DNS　6．3g于500mL大烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，加入2mol／L　NaOH溶液262mL，再加到500mL含有185g酒石酸钾钠（C4H4O6KNa·4H2O，MW＝282．22）的热水溶液中，再加5g结晶酚（C6H5OH，MW＝94．11）和5g无水亚硫酸钠（Na2SO3，MW＝126．04），搅拌溶解，冷却后移入1000mL容量瓶中用蒸馏水定容至1000mL，充分混合均匀。贮于棕色瓶中，室温放置一周后使用。

（3）0．05mol／L、pH值分别为4．5和5．0的柠檬酸缓冲液。

①A液（0．1mol／L柠檬酸溶液）。准确称取21．014g柠檬酸（C6H8O7·H2O，MW＝210．14）于500mL大烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，移入1000mL容量瓶中，用蒸馏水定容至1000mL，充分混合均匀。放入冰箱中，于4℃下保存备用。

②B液（0．1mol／L柠檬酸钠溶液）。准确称取29．412g柠檬酸钠（Na3C6H5O7· 2H2O，MW＝294．12）于500mL大烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，移入1000mL容量瓶中，用蒸馏水定容至1000mL，充分混合均匀。放入冰箱中，于4℃下保存备用。

③0．05mol／L、pH＝4．5的柠檬酸缓冲液。取上述A液27．12mL，B液22．88mL，充分混合均匀后移入100mL容量瓶中，用蒸馏水定容至100mL，充分混合均匀。放入冰箱中，于4℃下保存备用，用于测定滤纸酶活力。

④0．05mol／L、pH＝5．0的柠檬酸缓冲液。取上述A液20．5mL，B液29．5mL，充分混匀后移入100mL容量瓶中，用蒸馏水定容至100mL，充分混合均匀。放入冰箱中，于4℃下保存备用，用于测定C1酶的活力。

（4）5．1g／L羧甲基纤维素钠（CMC）溶液。精确称取0．51g　CMC于100mL小烧杯中，加入适量0．05mol／L、pH＝5．0的柠檬酸缓冲液，加热溶解后移入100mL容量瓶中，用0．05mol／L、pH＝5．0的柠檬酸缓冲液定容至100mL，充分混合均匀。放入冰箱中，于4℃下保存备用，用于测定CX酶的活力，用前充分摇匀。

（5）5g／L水杨酸酐溶液。准确称取0．5g水杨酸酐于100mL小烧杯中，用少量0．05mol／L、pH＝4．5的柠檬酸缓冲液溶解后，移入100mL容量瓶中，用0．05mol／L、pH＝4．5的柠檬酸缓冲液定容至100mL，充分混合均匀。放入冰箱中，于4℃下保存备用，用于测定β－葡萄糖苷酶的活力。

（6）5g／L纤维素酶液。准确称取纤维素酶制剂500mg于100mL小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，移入100mL容量瓶中，用蒸馏水定容至100mL，充分混合均匀。放入冰箱中，于4℃下保存备用。

三、操作方法和步骤

1．葡萄糖标准曲线的制作

取8支洗净烘干的20mL具塞刻度试管，编号后按下表数据加入标准葡萄糖溶液和蒸馏水，充分摇匀，配制成一系列不同浓度的葡萄糖溶液。向各试管中加入0．0276mol／L 的DNS溶液1．5mL，摇匀后在沸水浴中加热5min，取出冷却后用蒸馏水定容至20mL，并充分混合均匀。在540nm波长下，以1＃试管溶液作为空白对照，调零点，测定其他各试管溶液的光密度值，并记录结果。以葡萄糖含量（mg）为横坐标，以对应的光密度值为纵坐标，在坐标纸上绘制出葡萄糖标准曲线。

葡萄糖标准曲线制作数据表

2．滤纸酶活力的测定

取4支洗净烘干的20mL具塞刻度试管，编号后各加入5g／L的纤维素酶液0．5mL 和0．05mol／L、pH＝4．5的柠檬酸缓冲液1．5mL，向1＃试管中加入0．0276mol／L的DNS溶液1．5mL以钝化酶活性，作为空白对照，比色时调零用。将4支试管同时在50℃水浴中预热5～10min，再各加入滤纸条50mg（新华定量滤纸，剪成0．5cm×0．5cm），50℃水浴中保温1h。取出后立即向2＃、3＃、4＃试管中各加入0．0276mol／L的DNS溶液1．5mL以终止酶反应，充分摇匀后在沸水浴中加热5min，取出冷却后用蒸馏水定容至20mL，并充分混合均匀。以1＃试管溶液为空白对照调零点，在540nm波长下分别测定2＃、3＃、4＃试管溶液的光密度值，并记录结果。

根据3个重复光密度的平均值，在标准曲线上查出对应的葡萄糖含量，按下式计算出滤纸酶活力（U／g）。将在上述条件下，每小时由底物生成1μmol葡萄糖所需的酶量定义为一个酶活力单位（U）。

式中：5．56——1mg葡萄糖的物质的量，μmol（1000／180＝5．56）。

3．C1酶活力的测定

将5g／L的纤维素酶原液稀释10～15倍后用于测定C1酶活力，以脱脂棉为底物。

取4支洗净烘干的20mL具塞刻度试管，编号后各加入50mg脱脂棉和0．05mol／L、pH＝5．0的柠檬酸缓冲液1．5mL，并向1＃试管中加入0．0276mol／L的DNS溶液1．5mL以钝化酶活性，作为空白对照，比色时调零用。将4支试管同时在50℃水浴中预热5～10min，再各加入稀释后的纤维素酶液0．5mL，50℃水浴中保温24h。取出后立即向2＃、3＃、4＃试管中各加入0．0276mol／L的DNS溶液1．5mL以终止酶反应，充分摇匀后在沸水浴中加热5min，取出冷却后用蒸馏水定容至20mL，并充分混合均匀。以1＃试管溶液为空白对照调零点，在540nm波长下分别测定2＃、3＃、4＃试管溶液的光密度值，并记录结果。

根据3个重复光密度的平均值，在标准曲线上查出对应的葡萄糖含量，按下式计算出C1酶活力（U／g）。将在上述条件下反应24h，由底物生成1μmol葡萄糖所需的酶量定义为一个酶活力单位（U）。

式中：24——酶活力定义中的24h。

4．CX酶活力的测定

将5g／L的纤维素酶原液稀释5倍后用于测定CX酶活力，以CMC为底物。

取4支洗净烘干的20mL具塞刻度试管，编号后各加入5．1g／L　CMC溶液1．5mL，并向1＃试管中加入0．0276mol／L的DNS溶液1．5mL以钝化酶活性，作为空白对照，比色时调零用。将4支试管同时在50℃水浴中预热5～10min，再各加入稀释后的纤维素酶液0．5mL，50℃水浴中保温30min。取出后立即向2＃、3＃、4＃试管中各加入0．0276mol／L 的DNS溶液1．5mL以终止酶反应，充分摇匀后在沸水浴中加热5min，取出冷却后用蒸馏水定容至20mL，并充分混合均匀。以1＃试管溶液为空白对照调零点，在540nm波长下分别测定2＃、3＃、4＃试管溶液的光密度值，并记录结果。

根据3个重复光密度的平均值，在标准曲线上查出对应的葡萄糖含量，按下式计算出CX酶活力（U／g）。将在上述条件下，每小时由底物生成1μmol葡萄糖所需的酶量定义为一个酶活力单位（U）。

5．β－葡萄糖苷酶活力的测定

取4支洗净烘干的20mL具塞刻度试管，编号后各加入5g／L水杨酸酐溶液1．5mL，并向1＃试管中加入0．0276mol／L的DNS溶液1．5mL以钝化酶活性，作为空白对照，比色时调零用。将4支试管同时在50℃水浴中预热5～10min，再各加入5mg／mL纤维素酶液0．5mL，50℃水浴中保温30min。取出后立即向2＃、3＃、4＃试管中各加入0．0276mol／L的DNS溶液1．5mL以终止酶反应，充分摇匀后在沸水浴中加热5min，取出冷却后用蒸馏水定容至20mL，并充分混合均匀。以1＃试管溶液为空白对照调零点，在540nm波长下分别测定2＃、3＃、4＃试管溶液的光密度值，并记录结果。

根据3个重复光密度的平均值，在标准曲线上查出对应的葡萄糖含量，按下式计算出β－葡萄糖苷酶活力（U／g）。将在上述条件下，每小时由底物生成1μmol葡萄糖所需的酶量定义为一个酶活力单位（U）。

附录三　漆酶活力的测定

一、测定原理

漆酶分解2，2′－连氮－双－3－乙基苯并噻唑－6－磺酸（简称ABTS）的产物为ABTS自由基，然而在420nm处，ABTS自由基的吸光系数远大于底物ABTS。随着ABTS自由基浓度的增加，光密度值变大。将光密度值在某一规定范围内变化时所经历的时间定义为漆酶活力。一个漆酶活力单位（U）是指在特定条件下，每分钟能转化1μmol底物（ABTS）的酶量。

二、主要试剂和仪器

1．主要试剂

（1）漆酶Q1。固体粉末，最适温度为25℃，最佳pH＝7．0。

（2）漆酶Q2。透明液体，最适温度为50℃，最佳pH＝7．0。

（3）ABTS。作为测定漆酶活力的底物。

2．主要仪器

722型或其他型号的可见分光光度计。

三、测定方法

采用ABTS为底物；测定前先适当稀释漆酶，使漆酶稀释液的活力为27．7～55．3U／mL。

在漆酶最适温度和最佳pH值条件下，测定漆酶催化分解0．5mmol／L　ABTS，使420nm波长下的光密度值从0．15增加到0．20所经历的时间t。改变稀释倍数，使t值在10～20s范围内。

漆酶的活力按下式计算：

式中：0．1844——ABTS自由基浓度与光密度值的关系曲线的斜率；

60——秒与分钟的换算关系。