第九节 试验问题和处理分析的程序
一、试验注意事项
1．试剂和材料要求严格无菌，所有试验步骤一定要在无菌条件下实施，在细胞采集时存在污染的风险，在这个步骤要求加入抗生素，而在试验中不加抗生素。
2．组织培养应用的塑料器具，一定要具有高质量和好的透明度，并且，没有毒性，成纤维细胞不能附着在培养皿的底部。
3．精确地加入MCM，对于获得正确的甲基纤维素和毒物的最终浓度非常关键。
4．细胞在孵箱培养期间，孵箱内要求达到足够大的湿度，因为干燥可以减少克隆形成（要随时核实孵箱的蒸发率）。
5．在计数克隆时，有几个关键点：①应用20～25倍放大（不是40倍），具有最好的计数条件和评价克隆形态学；②正确地区分克隆和细胞簇，对每个细胞聚集认真计数细胞数量；③当接种高浓度细胞出现许多克隆生长时，认真检查平皿的边缘；④在观察中，平皿中克隆数量越多越难于计数，散在克隆可能丢失计数；⑤不同类型的克隆，如压缩型、扩散或散在型、多核型、爆裂形成单位型，均被认为是克隆。
6．关于毒物配制，重要的是要知道溶解度，选择最好和最小毒性的溶剂，而且，为了最小的变异，建议从同样毒物贮备液浓度开始稀释。
7．在将毒物贮备液加入培养皿之后，将剩余在试管内的毒物稀释液放在20℃贮存。如果CFU-GM抑制显现非线性时，用HPLC证实毒物浓度是否正确。
二、问题及解决程序(www.xing528.com)
1．在所有对照培养皿中无克隆形成。
（1）可能原因：①MCM浓度太高；②蒸发率太高；③一些试剂的毒性，使GM-CSF功能丧失。
（2）解决办法：①检查MCM配制、加入的IMDM及FBS的体积；②检查蒸发器、CO2百分率、温度；③检查所用试剂。
2．细胞增殖程度相同，但是，无克隆形成。
（1）可能原因：①MCM浓度太低；②纯MCM的可溶性（平皿中出现不溶解的MCM）。
（2）解决办法：①检查MCM配制，检查加入的IMDM及FBS的体积；②在MCM配制时要从较浓的贮备液开始配制。
3．难于计数克隆。原因是接种细胞太多，在MCM中不能很好扩散。解决办法是减少接种细胞数量，充分混匀试管。
4．成纤维细胞附着在培养皿底部。可能的原因是细胞混悬液不能很好地被过滤，塑料器具质量差。解决办法是降低过滤膜孔径，或者更换不同生产商的产品。
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