小型化CFU-GM试验标准操作规程及图谱

第六节　小型化CFU-GM试验的标准操作规程

一、概　述

小型化CFU-GM试验，适用于高通量筛选或供试品较少的情况。

二、材　料

4ml圆底试管和平底96孔板。

三、配制甲基纤维素培养基贮备液

1．根据基础试验方案的1到3步骤配制，并在4ml圆底试管中准备1ml甲基纤维素培养基。

四、CFU-GM试验

2．在试验的前夜，完全融化12支1ml MCM（放在4℃过夜），12支试管分别为CTRL₁、CTRL₂、CTRL₃（线性对照）；D₀（赋形剂对照）；D₁到D₈（供试品稀释液）。每支试管含有1ml甲基纤维素培养基。

3．根据方案1处理，应用含有30％ FBS的IMDM，配制三种人类造血细胞混悬液，浓度分别为2.35×10⁶个细胞/ml、1.17×10⁶个细胞/ml、0.58×10⁶个细胞/ml。根据与不同塑料器具、试剂有关变异，实验室应该研究接种细胞数量与克隆数量之间的关系。对于毒物试管，选择接种的细胞浓度获得每皿18～25个克隆的细胞浓度。

4．应用100μl无菌双蒸水充满96孔板皿的外部，确保好的湿度。(www.xing528.com)

5．根据特定SOP，在应用之前配制药物和溶剂贮备液。

6．应用已证实的微量加样器，取25μl含有30％ FBS的IMDM，加入到试管CTRL₁、CTRL₂、CTRL₃中；取19.5μl含有30％ FBS的IMDM，加入到试管D₀、D₁到D₈中。

7．配制200倍毒物稀释溶液。

8．在试管D₀中，加入5.5μl溶剂，在试管D₁到D₈中加入5.5μl每种200倍毒物稀释溶液，每只试管旋转振荡两次，每次5秒钟。在加入毒物后，每只试管最终体积为1.025ml。

9．在每支相应试管中加入75μl细胞悬液；CTRL₁为0.58×10⁶个细胞/ml；CTRL₂、D₀、D₁到D₈为1.17×10⁶个细胞/ml；CTRL₃为2.35×10⁶个细胞/ml。充分旋转振荡三次，每次8秒钟，试管静置放置5分钟，释放出气泡。

10．根据下列方案，从步骤9，将每个混合物0.1ml，加入到5个相应的重复皿中，CTRL₁从2B到2F；CTRL₂从2G到6G；CTRL₃从7G到11G；D₀加入三个纵行3B到3F；D₁到D₈加入到剩余的4到11纵行皿中。

11．在5％ CO₂湿化孵箱中，37℃培养，人类细胞培养14天，啮齿类细胞培养7天，注意一定要测定蒸发率。

五、计数克隆

12．计数培养皿中的克隆数量和形态，分析数据。