制备啮齿类造血祖细胞（m-BM）的操作程序及图谱

第三节　制备啮齿类造血祖细胞（m-BM）的标准操作程序

一、概述

从啮齿类动物骨髓分离造血祖细胞，经冲洗、检查存活和检查污染，再混悬到需要的细胞浓度。

二、材料

①雄性DBF/1（C₅₇B₁/6×DBA-2）小鼠，8～12周龄；②70％（V/V）乙醇；③Iscove修改的Dulbecco 氏培养基（IMDM），含有2mM 谷氨酸，补充100V/ml青霉素，100μg/ml链霉素；④IMDM含有2mML-谷氨酸，没有抗生素；⑤IMDM含有2mM 谷氨酸，含有30％（V/V）FBS，没有抗生素；⑥用Hank氏平衡盐溶液配制0.2％（W/V）台盼蓝溶液；⑦Turk溶液；⑧纱布；

⑨外科手术器械，如小剪刀，镊子等；⑩150mm培养皿

带23到5号针头的5ml注射器15ml

和50ml离心管；100ml细胞过滤器。

三、分离m-BM细胞

1．在不麻醉条件下，脱臼处死三只小鼠，在处死动物之后，尽可能快地用70％乙醇充分冲洗小鼠，用浸有70％乙醇的纱布包裹小鼠1～2分钟。

2．移除小鼠腿部皮肤，分离完整股骨，应用小剪刀和镊子切除连接肌肉和股骨上附着组织。(www.xing528.com)

3．将6个股骨放入含有10ml补充青霉素和链霉素的IMDM的150mm培养皿中，放在冰上冰浴。

4．清理掉膝部关节软骨，从股骨头的正下方切除末端。

5．用镊子夹住股骨，从膝端骨髓腔插入带有23～25号针头的5ml注射器，应用不加抗生素的IMDM，每根股骨应用1.5ml，冲出骨髓，将所有采集的骨髓细胞放入一个15ml圆底试管中或50ml离心管中。

6．应用5倍体积的IMDM及注射器，吸进及推出冲洗，再混悬BM细胞。

7．通过离心冲洗细胞，在室温条件下，400g离心10分钟，丢弃上清液，应用含有30％ FBS的IMDM，没有抗生素，重新混悬细胞沉淀，每根股骨应用1ml。

四、计数细胞和配制细胞悬液

8．取450ml含有0.2％（W/V）台盼蓝的HBSS稀释50μl细胞悬液，应用红细胞计数板计数活细胞数量，随后，再取450ml Turk溶液稀释50μl细胞悬液，应用红细胞计数板，计数及检查粒细胞污染。在该试验中细胞密度参考单核细胞计数（MNC）（Mononuclear Cell，MNC）。粒细胞是多型核细胞（Polymorphonuclear Cell，PMNC），它通过释放裂解酶干扰CFU-GM克隆形成。最大可接受的PMNC污染是10％～15％。较高的污染水平，建议用密度梯度离心法再次离心。

9．应用含有30％ FBS的IMDM，调整悬液的细胞浓度到1.5×10⁶个活细胞/mL。

10．应用含有30％ FBS的IMDM，根据试验方案要求，稀释细胞悬液到所需浓度。在CTRL₁最终细胞浓度为每皿2500个细胞，配制红细胞悬液浓度为0.04×10⁶个细胞/mL；CTRL₂最终细胞浓度为每皿10 000个细胞，配制红细胞悬液浓度为0.1×10⁶个细胞/mL；CTRL₃、D₀、D₁到D₈最终细胞浓度为每皿40 000个细胞，配制红细胞悬液浓度为0.6×10⁶个细胞/mL。在相应试管中，加入0.3ml每种细胞悬液。