第二节 制备人类造血祖细胞标准操作程序
一、概述
从新鲜或冻存的人类脐带血分离人类造血祖细胞。
二、材料
①柠檬酸—磷酸—葡萄糖溶液（CPD）；②新鲜人类脐带血（hu-CB）或冻存分离的脐带血细胞（hu-CBC）；③缺钙锂塩（Dulbecco）或磷酸缓冲盐溶液（CMF-DPBS）；④Ficoll-paque 溶液，贮存温度为4℃，避光保存；⑤应用Hank氏平衡盐溶液溶解的0.2％（W/V）台盼蓝溶液；⑥Turk溶液；⑦Iscove修改的Dulbecco 培养基（IMDM），含有2mM L-谷氨酸，含有40％（V/V）胎牛血清；⑧冻存培养基；⑨70％（V/V）乙醇；⑩Iscove修改的Dulbecco 培养基（IMDM），含有2mM L-谷氨酸，含有30％（V/V）胎牛血清；
15ml和50ml离心管。
三、采集hu-CB
1．在50ml试管中，加入7mlCPD溶液，一般应用1.4份CPD加10份脐带血。
2．在室温条件放置试管。
3．在正常分娩之后，采集43ml新鲜人类脐带血（hu-CB），在无菌条件下进行，并结合CPD溶液。
4．标本室温放置和用于培养，或在采集后的24小时内冻存。
四、分离hu-CB细胞
在密度梯度离心分离之前及期间，将Ficoll-paque和hu-CB标本放置在室温下。
1．应用CMF-DPBS与脐带血1∶1（V/V）稀释，确定总体积。
2．倒置Ficoll液体几次，确保充分混匀。
3．在15ml离心管中，加入1个体积（如5ml）的Ficoll-paque液体，在其顶部加入2个体积（如10ml）的稀释脐带血标本，与Ficoll-paque分层，不与其混合。
4．在不减速条件下，在18℃～20℃下、400g离心分离30分钟。
5．应用吸管吸掉上层，让单核细胞层界面不被干扰。
6．应用吸管将单核细胞层转移到一个干净的50ml离心管中。
7．向该试管（单核细胞中）加入3个体积的CMF-PBS，用吸管轻柔地吸进推出，重新混悬细胞。
8．在18℃～20℃下、400g离心10分钟，用吸管吸掉上清液弃去。
9．为了冲洗细胞，重复步骤11和12。(www.xing528.com)
10．用0.5ml CMF-PBS及吸管，重新混悬细胞。
11．用含有0.2％台盼蓝的450mlHBSS稀释50ml细胞悬液，应用红细胞计数板计数存活的细胞百分比。然后应用450ml Turk溶液稀释50ml细胞悬液，计数细胞，检查粒细胞污染。
在该试验中细胞密度称为单核细胞计数。粒细胞是多型核细胞（PMNC），它可以释放裂解酶，干扰CFU-GM形成；PMNC粒细胞最大可接受的污染是10％～15％，如存在较高的污染水平，建议采用密度梯度离心再次分离MNCs。
五、冻存hu-CB细胞
1．应用含有40％ FBS的IMDM，调整细胞悬液到细胞浓度为：每毫升为4×106到4×107个细胞。
2．应用冻存溶液1∶1（V/V）稀释细胞悬液，使细胞最终浓度为：2×106到2×107个细胞/ml。
3．立即将细胞悬液分装到1ml冻存管中，放在−80℃下冻存24小时，然后，再转移到液氮中。
六、融化hu-CB细胞
1．加温融化培养基到37℃，在37℃水浴，快速融化冻存细胞的冻存管，应用70％乙醇擦拭冻存管外部。
2．从冻存管无菌转移2ml融化的细胞悬液到15ml圆锥形试管中。
3．应用1ml预温融化培养基冲洗冻存管，将冲洗液加入到15ml圆锥试管中，轻柔旋转该试管1分钟以上。
4．在15ml试管中，缓慢加入预温融化的培养基到体积达7ml为止，轻柔旋转、振荡3分钟以上。
5．在室温离心该细胞悬液，200g离心15分钟。
6．仔细吸掉大部分上清液，保留约2ml使细胞沉淀不被搅动，用吸管轻柔地混悬细胞。
7．缓慢添加5ml预温融化的培养基到细胞悬液中，轻柔旋转并振荡。
8．在室温离心该细胞悬液，200g离心15分钟。
9．用吸管仔细移除所有培养基，应用含有30％ FBS的0.5ml IMDM，重新混悬细胞沉淀，应用0.2％台盼蓝和红细胞计数板计数细胞，应用450ml Turk溶液，加入50ml细胞悬液，再次计数细胞，检查粒细胞污染。
10．应用含有30％的FBS的IMDM，稀释细胞浓度到1.5×106细胞/ml。
11．应用含有30％的FBS的IMDM，根据试验方案的要求，稀释细胞悬液到需要的浓度。在CTRL1最终细胞浓度为每皿10 000细胞，制备的细胞悬液浓度为0.147×106个细胞/mL；CTRL2最终细胞浓度为每皿25 000细胞，制备的细胞悬液浓度为0.367×106个细胞/mL；CTRL3、D0、D1到D8细胞浓度为每皿75 000细胞，制备的细胞悬液浓度为1.1×106个细胞/mL；将每个细胞悬液0.3ml加入到相应试管中。
免责声明：以上内容源自网络，版权归原作者所有，如有侵犯您的原创版权请告知，我们将尽快删除相关内容。
