药物和化学物质外骨髓毒性评价操作规程及图谱

第一节　测定药物和化学物体外骨髓毒性效应的标准操作程序

一、概　述

这是一个标准化的GLP符合性程序，以人脐带血（human cord blood，hu-CB）或小鼠骨髓（mouse bone marrow，m-BM）细胞为实验体系，体外暴露于供试品，hu-CB培养14天，m-BM培养7天，计数培养细胞的克隆数量和形态。

该程序可以直接检测毒性，但是，不能精确预测可能的前毒物的人类最大耐受剂量（Maximum Tolerated Dose，MTD）。

该程序用于证实该预测模型的小鼠MTD值和人类MTD值的比较，来源于精确的、同样的毒物暴露途径和类似给药方案。特定给药方案依赖于许多骨髓毒物，重要的是在种属、给药途径和给药方案之间匹配，确保CFU-GM实验能够测量出真正的种属间差异，而能够精确检测出在同样靶器官的效力差异。

二、材　料

①甲基纤维素培养基（MCM）（Methylcellulose Culture Medium，MCM）；②供试品、赋形剂、稀释剂；③IMDM培养基（Iscove’s Modified Medium，IMDM），含有30％（V/V）胎牛血清（Fetal Bovine Serum，FBS），含有2ml L-谷氨酸；④分离的细胞；⑤带18号针头的10ml注射器；⑥14ml圆底聚苯乙烯试管；⑦直径为35mm的培养皿；⑧带14号针头的1ml注射器；⑨37℃，5％ CO₂孵箱；⑩直径为60mm培养皿；直径为60mm网格化培养皿；倒置显微镜。注意：对于组织培养，一定要应用高质量的塑料器具。

三、配制甲基纤维素培养基贮备液

1．通过反转倒置瓶子，使甲基纤维素培养基均匀化，MCM新鲜配制或将冻存MCM（温度为4℃）过夜融化。

2．应用带18号针头的10ml注射器，处理所有MCM，从瓶中移到15ml圆底试管中，贮存温度为−20℃。根据需要，融化贮存的试管数量。注意：精确处置MCM是后续步骤获得准确甲基纤维素和毒物正确的最终浓度的关键；如果该培养基沿试管壁黏附，离心该试管（140g离心，离心30秒），使培养基移到试管底部。

3．在稀释之前，应根据供应商的指示贮存供试品、赋形剂和稀释剂。

四、CFU-GM实验程序

1．在实验日的前夜，完全融化甲基纤维素培养基，在温度为4℃下过夜。试管贴标志如下：每一个实验应用12个试管培养物，制备线性对照培养皿CTRL₁、CTRL₂、CTRL₃，制备赋形剂对照培养皿D₀，制备药物曲线（供试品）培养皿D₁到D₈，每只试管放4ml甲基纤维素培养基。

2．在孵箱的托盘上（架上），放置贴上与相应试管对应的3个直径为35mm的培养皿。

3．根据相应的SOP，在应用之前，配制药物（供试品）和溶剂贮备液。

4．在试管CTRL₁、CTRL₂、CTRL₃中，分别加入含有30％ FBS的IMDM 100ml；在试管D₀到D₈中，分别加入78μl含有30％ FBS的IMDM。

5．在室温条件下，应用无菌1.5ml试管及适当溶剂，从D₀到D₈逐渐增加浓度，配制供试品稀释液，配制比最终培养基浓度高200倍的稀释液。对于每一套培养物，配制溶液对照（D₀），以证实溶液的毒性。通过这种方式，所有药物稀释剂采用同样溶剂浓度−0.5％，对于二甲基亚砜（DMSO）（最常用的溶剂之一），确定毒性效应的阈值。在任何情况下，特别是在不容易获得溶剂血液毒性信息的情况下，建议单独进行基础实验，测定所有溶剂的最大非毒性浓度。在研究中当不知道分子的毒性时，建议分两个阶段进行试验：首先进行筛选试验，检测IC₁₀、IC₅₀、IC₉₀值的范围，然后，再进行更窄剂量范围的试验，以测定精确的OC值。

5．应用证实的微量加样器，取22μl赋形剂或22μl每种毒物稀释液，加入到相应的甲基纤维素试管中，每只试管振荡两次，每次5秒钟。在加入毒物后，每只试管中的最终体积应该是4.1ml。(www.xing528.com)

6．立即给每支试管加入0.3ml细胞混悬液，轻柔摇动试管，使其混匀，然后用力振荡3次，每次8秒钟，让试管静置5分钟，待气泡放出。

7．用带有14号针头的1ml注射器，分别取1ml细胞培养基混合物，加入到三个相应培养皿的每个皿中（步骤5），轻柔旋转平皿，均匀扩散分布混合物，使其呈新月形附着在平皿壁上。

8．测定孵箱的蒸发率，确保其值能够被接受：①准备三个直径为60mm的培养皿（面积28.27cm²），加入10ml双蒸水（Vs=开始体积）；②在孵箱中部架的中央，放置培养皿；③在放置72小时后，测量每只培养皿中水的体积（Vf=最终体积）；④计算每只培养皿的蒸发率（Evaporation Rate，ER），ER（单位ml×h⁻¹×cm⁻²）= Vs−Vf/h×A=V₇₂/2.035；⑤计算三个培养皿的平均值及标准差；ER值范围在1.1～1.7为非常好；ER在1.7～2.1好；ER在2.1～2.7为可以接受；ER大于2.7为不能接受。在细胞培养期间，保持足够的湿度是关键，因为培养物干燥可以减少克隆形成。

9．细胞在37℃、5％ CO₂的湿化孵箱中培养，啮齿类骨髓细胞培养7天，人类脐带血细胞培养14天。对于接种细胞数量与计数的克隆数之间的关系的线性分析，每次试验带有内部对照的为三皿试验。这些对照是三个标准化细胞密度，对于人类脐带血细胞：CTRL₁每皿10 000个细胞，CTRL₂每皿25 000个细胞，CTRL₃每皿75 000个细胞。对于啮齿类骨髓细胞：CTRL₁每皿2500个细胞，CTRL₂每皿10 000个细胞，CTRL₃每皿40 000个细胞。仅在一个细胞浓度，相应于CTRL₃皿进行药物毒性研究。

五、计数克隆数量

在人类脐带血细胞培养14天后，啮齿类细胞培养7天之后，计数克隆数量。

1．将培养皿放入60mm网格化组织培养皿内，用35mm平皿细分表面为较小的区域，方便进行克隆计数。

2．应用倒置显微镜（20倍到25倍放大）扫描整个培养皿，计数CFU-GM克隆；聚集的细胞数≥50定义为CFU-GM克隆。聚集的细胞数在20～50，定义为簇。为了正确区分克隆和簇，一定要认真评价每个细胞聚集的细胞数量。关键是应用20～25倍放大，不用40倍放大，当在接种高密度细胞时，在克隆大量形成的地方，特别注意检查该平皿的边缘部分。

3．在重复计数一个D₈重复皿之后，随机重复计数另一个试验组的一只平皿，接着计数下一个D₈重复平皿，然后再从剩余组取第二个重复平皿随机计数，按这种程序计数第三个重复平皿。

六、观察克隆形态

计数、观察克隆外形

①压缩致密型克隆，具有中央浓密的核和外周光环，这些克隆非常容易计数。

②散布或扩散型克隆，没有明显的核，一定要在放大的情况下认真观察，因为大于30倍放大，可能漏检这种类型的克隆。

③多核克隆，在附近有两个或多个浓密的核，在该平皿的同样深度，常见周边有光环。

④爆发性形成单位BFUs（Burst-Forming Units，BFUs），多灶性克隆，有几个克隆或簇聚集，有或没有周边光环。

为了正确应用预测模型，不同类型的克隆，如压缩型、散在型、多核型和爆发型克隆，均简单计数为克隆。为此，在计数克隆时，不考虑克隆形态，但是，单独保存这种痕迹。在平皿具有高克隆密度时（每皿大于150个克隆），有时可能难于计数散在的/扩散性克隆，这是建议不计数非常高克隆数量的原因之一。