毒理学安全性评价骨髓细胞学研究图谱助您准确操作

第一节　大鼠与小鼠骨髓细胞检查标准操作程序

一、大鼠骨髓细胞采集及应用细胞离心涂片机制备大鼠骨髓细胞涂片

（一）目的

规范应用细胞离心涂片机制备大鼠骨髓细胞涂片的程序。

（二）材料

1．器械：剪刀、骨剪、尖头镊子、10～15ml玻璃试管、尖头玻璃滴管、橡胶头、干净载玻片（将载玻片放入95％乙醇溶液中，浸泡2小时以上，用纱布拭干乙醇，再用绸布擦亮备用）。

2．血清：胎牛血清或应用同种动物的血清。

3．仪器准备：将标有动物编号的载玻片、双孔滤纸固定于固定夹及漏斗之间，放入细胞离心机备用。

（三）程序

1．完整摘取大鼠股骨，用骨剪从膝关节向髋关节处纵剖，使骨髓暴露。

2．用尖头镊子，将骨髓内容物混合均匀，用镊子取出少量骨髓，大约0.5mm³，放入事先装有1.5～2ml血清的试管中。

3．再用尖头玻璃滴管反复吹打30次左右，抽吸混有骨髓的血清，使骨髓细胞均匀分散其中。注意，尽量不要将血清吹打出气泡。

4．用微量加样器取骨髓细胞液30～50μl（视所取骨髓量而定），加入细胞离心涂片机的小漏斗中，以600～800转、离心10分钟，取出载玻片，涂片标本制作完成。

注意事项：①在处死动物后，在尽可能短的时间内摘取动物股骨并采集骨髓细胞，关键是完整取出股骨，剔除附着的肌肉；②摘除股骨后，尽快采集骨髓细胞，不要让骨髓接触空气过久；③骨髓细胞涂片标本制作完成后，需干燥20分钟以上，再进行染色。

二、旋转器制备大鼠骨髓细胞涂片

（一）目的

规范旋转器制备大鼠骨髓细胞涂片的程序。

（二）材料

1．器械：剪刀、骨剪、镊子、2ml注射器、18号长7厘米的针头、10～15ml玻璃试管、尖头玻璃滴管、橡胶头、干净载玻片（将载玻片放入95％乙醇溶液中，浸泡2小时以上，用纱布拭干乙醇，再用绸布擦亮备用）。

2．血清：胎牛血清或同种动物血清。

（三）程序

1．完整摘取大鼠股骨，在股骨两端齐关节处，用骨剪沿横切面剪开，暴露骨髓腔。

2．用2ml带18号针头的注射器，自一端刺入骨髓腔，用血清将骨髓冲洗至玻璃试管中，再从另一端冲洗骨髓腔，确保大鼠整根股骨腔中骨髓细胞完全被冲洗出来。

3．用尖头玻璃滴管抽吸混有大鼠骨髓细胞的血清，反复吹打30次左右，使骨髓细胞均匀分散其中。注意，尽量不要将血清吹打出气泡。

4．以600转/分、离心5分钟，弃上清液后，用玻璃滴管将沉淀的骨髓细胞轻轻吹散；将制备好的骨髓细胞悬液滴在载玻片上，应用Spinner旋转涂片机，在1.0秒钟内进行涂片，制作骨髓细胞标本。

注意事项：①在处死动物后，在尽可能短的时间内摘取动物股骨并采集骨髓细胞，关键是完整取出股骨，剔除附着的肌肉；②摘除股骨后，应尽快采集骨髓细胞，不要让骨髓接触空气过久；③骨髓涂片标本制作完成后，需干燥20分钟以上，再进行染色。

三、大鼠骨髓细胞涂片的Wright-Giemsa 染色程序

（一）目的

规范大鼠骨髓细胞涂片的Wright-Giemsa 染色程序。

（二）程序

1．5％ Giemsa染液配制：用M/150磷酸缓冲液（pH 6.8）与Giemsa原液按95∶5比例稀释而成。

2．将骨髓细胞涂片标本浸泡于Wright染液的染缸中，静置2分钟。

3．将骨髓细胞涂片标本移至5％ Giemsa染液中，上下轻振数次，静置20分。

4．水洗骨髓细胞涂片3～4次，干燥。

四、大鼠骨髓细胞涂片的May-Giemsa染色程序

（一）目的

规范大鼠骨髓细胞涂片的May-Giemsa染色程序。

（二）程序

1．5％ Giemsa染液配制（同上）。

2．50％ May-Grunwald染液配制：May-Grunwald原液与蒸馏水按1∶1比例稀释而成。

3．将骨髓细胞涂片标本浸泡于May-Grunwald原液中，静置3分钟。

4．将骨髓细胞涂片标本移至50％ May-Grunwald染液中，静置1分钟。

5．将骨髓细胞涂片标本移至5％ Giemsa染液中，上下轻振数次，静置20分。

6．水洗骨髓细胞涂片3～4次，干燥。

五、猴骨髓吸出和活检标准操作规程

（一）概述

骨髓吸出和活检技术是将一个硬的、带孔的针头插入长骨或扁平骨的骨髓腔中，吸出骨髓。在较大的非人灵长类动物中，已经报道有大量骨髓细胞采集部位可以应用，包括髂骨顶部的前面、股骨的坐骨结节和转子窝。通常，在非人灵长类动物的骨髓细胞采集部位，骨髓采集使用的方法类似于对犬的描述。

对于进行骨髓细胞采集的动物，应该适当进行麻醉，骨髓细胞采集或活检要求应用无菌技术，包括剔除采集部位的毛发，用聚乙烯吡啶酮-碘擦拭骨髓细胞采集部位并覆盖采集部位。

对于骨髓采集，要求用一个带中心探针的特殊针头。现在，可以从市场上获得几种不同类型的骨髓细胞采集针头，这些针头在长度、号码、斜面和处理类型方面不同，对于较小的NewWorld种属，应用20号、3.8厘米长的脊髓针头采集骨髓；应用Jamshidi针头、最小14号针头采集骨中的活检样品。

当进行骨髓采集时，应该注意以下几点：①注射器和针头在应用前，应该用肝素冲洗；②对重复采集骨髓样品的动物，轮换采集部位；③在骨髓采集后，应该进行镇痛处理。

（二）猴骨髓采集程序

1．将动物适当麻醉，腹侧位躺着。

2．剔除髂骨顶部的毛发（骨盆根部），应用聚乙烯吡啶酮-碘消毒局部皮肤并覆盖局部皮肤。

3．触摸髂骨顶部，应用外科手术刀片，在髂骨顶部的前面皮肤切一个切口。

4．通过切口插入骨髓穿刺针头，直到髂骨顶部脊的前面。

5．然后沿腹侧继续进针到髂骨顶部，通过恒定的压力，向前向后旋转针头。当进针时，该针头应该保持平行于髂骨的矢状面。

6．当针头进入骨皮质时，会感到阻力减小，然后固定（如果前面摆动，针头将不摆动）。

7．从针头中移出探针，连接20ml注射器，通过拉出注射器栓产生负压，吸出骨髓进入注射器内。

8．如果没有吸出骨髓，旋转针头90°～180°，重新吸取骨髓细胞。如果仍不能吸出骨髓，稍微进针或撤针，重新吸取骨髓细胞。

9．骨髓细胞标样是暗红色的，比血液更黏稠，并含有灰白色骨针状物。

10．对于诊断用标样，要求少于1ml，如果需要较大体积，应该从多部位采集。

11．对于骨髓标样采集，移出针头后，小切口用外科组织胶黏合或缝合切口。

（三）从坐骨结节采集骨髓细胞标本(www.xing528.com)

可以从恒河猴的坐骨结节采集少量骨髓标本，这个技术与从髂骨顶部采集的方法一样。对于这个技术，动物可以采用侧位或腹侧位躺着、后腿弯曲、紧贴该动物的身体，在动物坐骨硬结处（垫）触摸坐骨结节，并从该处插入骨髓针头，向动物头部方向并进入坐骨结节。样本采集同（二）的程序。

（四）从股骨转子窝采集骨髓细胞标本

对于较小动物（小于5kg）股骨转子窝是一个有用的采集部位，这个技术本质上与髂骨顶部采集的方法一样。对于这个技术，动物采用侧躺位，采集人用手紧握住动物股骨的大腿近端，转子窝位于中央，针头直接插入转子窝向股骨移动，进入髓腔，采集样本同（二）的程序。

（五）近端肱骨处采集骨髓细胞标本

从近端肱骨处采集骨髓细胞标本，对于小动物也是一个有用的部位。这个技术在本质上与股骨转子窝采集的方法一样，仅部位不同。对于这个技术，动物采用侧位躺着，采集人握住近端上肢，拇指放在肱骨的侧面。

（六）中心骨活检

从同样部位吸出骨髓获得的标本，骨活检和骨髓吸出的主要差异在固定包埋穿刺针头入骨内之后，应用针头吸出骨髓，在吸骨髓的情况下移出探针，连接注射器，应用负压抽出骨髓。在中心骨活检的情况下，移出探针，并进一步进针，进入骨内（1～2cm），通过轻柔旋转和稳定施压，然后，通过旋转和向前向后摇摆针头使针头转动，接着部分撤出针头，并再次插入骨内，重新定位针头，确保获得较大体积的标本。为了移出活检样品，应旋转针头并前后移动针头，然后平衡拉撤出。

六、骨髓涂片的评价程序

（一）目的

规范骨髓涂片的评价程序。

（二）程序

1．在显微镜下进行观察时，应该预先确定观察部位不要偏离。必须按从小到大的顺序逐渐放大倍数，以便观察整体状况。随后，在100倍油镜下，分类计数骨髓细胞。每张涂片至少应该计数500个细胞的各类细胞的百分比值。

2．骨髓细胞形态学分类

（1）骨髓细胞形态学分类方法有两种：一种方法是粗略分类即红细胞系（Erythrocytes series）、粒细胞系（Myeloid series）、淋巴细胞（Lymphocytes Series）等。即使是粗略分类，也能显示出各个细胞系的增减，所以，有助于与外周贫血相应的结果评价。另一种方法是以细胞直径为标准进行分类。除了分类外，还可以观察混杂的成熟红细胞数量的增减、具有小核的红细胞的出现、形态的异常（过分节、多倍体、分裂异常、胞质异常等）。混杂的成熟红细胞数量增加与减少，表示骨髓细胞的增生与减少。分类计数的骨髓细胞及英文缩写如表2-1所示。

表2-1

（续表）

（2）骨髓细胞增生标准

骨髓细胞增生以有核细胞占全部骨髓细胞的百分比表示。①极度增生，有核细胞占全部骨髓细胞的百分比在50％以上；②增生，有核细胞占全部骨髓细胞的百分比在10％以上；③正常，有核细胞占全部骨髓细胞的百分比为1％～10％；④减少，有核细胞占全部骨髓细胞的百分比在1％以下；⑤极度减少，有核细胞占全部骨髓细胞的百分比在0.5％以下。

正常情况下，在造血干细胞分化、发育到成熟的整个演变过程中，存在着一定的规律性。造血干细胞逐级分化形成各系列、各阶段的骨髓细胞，虽然造血干细胞在光学显微镜下无法鉴别，分化发育为各系列原始、幼稚细胞后，其形态学特征才较为明显，掌握这些规律对正确识别骨髓细胞的系列及其分化、成熟阶段是十分必要的。

（3）红系细胞形态学

红系细胞依分化顺序分为红系祖细胞、原红细胞、早幼红细胞、中幼红细胞、晚幼红细胞、网织红细胞和红细胞。红系祖细胞目前尚缺乏形态学了解。可以认识的红系各期形态概述如表2-2所示。红系细胞的基本特征为胞体胞核圆形、规则（形状基本一致）；大小及胞浆着色变化显著。

表2-2　红系各期形态概述

（4）粒系细胞形态学

粒系细胞依分化顺序分为粒系祖细胞、原粒细胞、分叶核粒细胞，并从早幼粒细胞开始依颗粒特性分为中性、嗜酸和嗜碱三种。粒系分化中最显著的特点是胞核的变化，从最早阶段的圆形到成熟阶段的杆状分叶，划分细胞阶段的主要依据便是其胞核发育中的变化，而胞质颗粒属性对判定是否对其他系细胞有意义。各期形态概述如表2-3所示。

嗜酸和嗜碱性细胞的胞核形态与中性粒细胞大致相似。一般在早、中幼粒细胞阶段起即可明显区别特殊颗粒。通常成熟嗜酸分叶核呈哑铃状，颗粒多而粗大，有中空感，呈暗红色至红棕色。嗜碱粒细胞胞核的结构常模糊，颗粒粗大常散在于胞核上，呈蓝紫色。

表2-3　粒系细胞各期形态

（5）单核、巨噬细胞形态学

依分化顺序可分为单核祖细胞、原单核细胞、幼单核细胞和单核细胞。单核细胞进入组织后或在骨髓中转化为巨噬细胞，其胞体胞核增大、胞质丰富、吞噬功能显著增强。

①原单核细胞——有两种形态：一为胞体大（直径12～22µm）而不规则（胞体胞核不规则），胞质丰富（胞核/胞质比例低），蓝紫色无颗粒；另一为胞体小（直径10～15µm）且较规则，核染色质纤细，胞核/胞质比例高，无颗粒。后一种原单核细胞仅凭形态学常常不易与原粒细胞区分，必要时可用CD系统检测以区别之。

②幼单核细胞——胞体直径为15～25µm，胞体胞核大多不规则，核染色质浓密，核仁隐约或无核仁，胞核常位于细胞中或偏向一侧。

③单核细胞——胞体直径为12～20µm，胞体圆形或不规则；胞核呈扭、曲、折，核膜粗糙，核染色质明显浓集；胞质丰富浅灰蓝色，也可呈浅红色，可含有细尘样颗粒，部分胞质少，类似T淋巴细胞。

④巨噬细胞——胞体大或巨大，直径为15～40µm；胞核呈不规则状，明显偏位；胞质十分丰富，为浅灰蓝色或浅红色，常含有空泡或吞噬少量细胞碎屑或成熟衰老的红细胞。

⑤组织细胞——一般认为组织细胞与巨噬细胞同义，组织细胞是单核细胞转化后的幼稚阶段，而巨噬细胞则为单核细胞转变后的成熟细胞。形态学上可见单核细胞向两者转化，但常将胞体大、不规则状、胞核大、核染色质疏松、可有核仁、胞质呈明显嗜碱性的（尤其在胞体周边）及几乎不见吞噬现象者称为组织细胞。

（6）淋巴及浆细胞形态学

淋巴及浆细胞系包括淋巴干细胞、淋巴祖细胞、原淋巴细胞、幼淋巴细胞和淋巴细胞，并分T和B两个系统。在抗原刺激下B淋巴细胞最后转化为浆细胞，可分为原浆细胞和幼浆细胞及成熟浆细胞。

①原淋巴细胞——胞体较小（直径为12～20µm）而规则；胞膜核膜厚而清晰；核仁0～3个，染色质呈粗粒状紫红色，胞核/胞质比例高；胞质较少，淡蓝色，无颗粒。

②幼淋巴细胞——胞体直径为10～18µm；核仁消失或模糊，核染色质有浓集倾向。

③淋巴细胞——分大小两种。大淋巴细胞胞体直径为10～15µm；胞核圆形或肾形常偏位，核染色质明显浓集，可见核仁痕迹；胞质丰富、淡蓝色或灰蓝色，可见少许紫红色嗜天青颗粒。这种含颗粒的淋巴细胞常与免疫分型上的自然杀伤细胞相似。小淋巴细胞胞体直径为6～10µm；胞核圆但有轻度不规则（如有小切迹），核染色质呈紧密块状、深紫红色；胞质少，一般无颗粒。淋巴细胞胞核不规则的多属T细胞。

④原浆细胞——胞体直径为14～20µm；胞核圆形或椭圆形，偏位或轻度偏位，约占细胞的2/3，核染色质细致均匀，核仁1～4个；胞质丰富，深蓝色。

⑤幼浆细胞——胞体直径为12～20µm；外形呈不规则状；胞核圆形或椭圆形，约占细胞的1/2，明显偏位，核染色质有浓集现象，核仁隐约或不见；胞质丰富、嗜碱性强或呈多染色性。

⑥浆细胞——胞体直径为8～15µm；胞核小，约占细胞的1/2，圆形或椭圆形，明显偏位，核染色质粗而浓集，间有空隙，一部分似车轮状；胞质丰富，深蓝色、灰蓝色或多色性。

（7）巨核细胞形态学

①原巨核细胞——原巨核细胞由巨核祖细胞分化而来，正常骨髓中不见或少见。胞体直径为10～30µm，外形不规则，可呈毛刺状突起；胞核大、类圆形，双核多见，核染色质呈疏松网状结构，核仁2～4个，淡蓝色；胞质较少，深蓝色，染色常不均匀呈层状或云雾状。

②幼巨核细胞——胞体直径为25～50µm，外形不规则；胞核巨大，为多个胞核紧缩或重叠在一起，核染色质明显聚集，核仁不定；胞质较丰富，呈蓝色，可在胞核处出现区域性颗粒，也可见少量血小板形成。

③颗粒型巨核细胞——胞体直径为40～70µm；胞核巨大，常重叠在一起呈不规则状或互相聚集成环状，核染色质粗密；胞质十分丰富，含细小紫红色颗粒。

④裸核型巨核细胞为巨核细胞仅见胞核者。

⑤血小板——直径为2～4µm，呈圆形或椭圆形的双凹盘状，往往成群出现；胞质周围染成淡蓝色，称为透明区，中央部分含有细小紫红颗粒，为颗粒区。

（8）其他细胞形态学

①网状细胞——为造血的支架细胞之一。胞体大小不一，呈星状或多突状，直径为10～40µm；胞核圆形无皱褶，染色质细致疏松呈网状；胞质丰富，浅灰蓝色或淡蓝色，近核处常较深，而细胞周边淡染，甚至难以看清其边界。

②肥大细胞——又称组织嗜碱细胞，胞体直径为8～25µm，外形变异大；胞核圆形，居中或偏位，染色质常被颗粒覆盖而结构不清；胞质丰富，常充满大小不一的深蓝、紫黑或暗紫红色的嗜碱颗粒，排列紧密。

③脂肪细胞——胞体直径为30～50µm，胞膜易破裂；胞核较小不规则，常被挤在一边，核染色致密，无核仁；胞质充满多量脂肪小球，有时呈大脂肪空泡。

④成骨细胞——胞体直径为20～40µm，长椭圆形或不规则形，单个或多个成簇分布；胞核圆形，常偏于一端，可见1～3个深蓝色核仁；胞质丰富，暗蓝色或蓝色，不均匀，离核较远处常有一淡染区，酷似鱼肚白。由于胞质偏于一侧呈裙边状，似飘扬的旗帜。

⑤破骨细胞——破骨细胞与成骨细胞是一对作用相反的参与骨代谢的细胞。破骨细胞起溶骨作用，胞体大，直径为20～100µm；胞核从数个至数十个不等，核仁明显；胞质丰富，含有粗大的暗红色或紫红色溶酶体颗粒。

3．临床前安全评价试验中的骨髓检查

（1）骨髓细胞计数结果

实验动物的股骨骨髓细胞数量差别很大。动物越小骨髓细胞数量越高。这种关系与血细胞的寿命和骨髓腔容积差有关。骨髓细胞的粒细胞系/红细胞系（M/E）为0.8～2.0，淋巴细胞数为10％～30％；小鼠为2.67±0.22、大鼠为2.12±0.19、非洲小型长尾猴为1.28±0.20、食蟹猴为0.64±0.17、犬为0.35±0.15。

（2）骨髓细胞分类计数正常值范围（见附录）。