中国对虾和三疣梭子蟹遗传育种的最新进展

2.2.1　染色体分析

我国海洋生物种质资源的研究起步较晚，直到20世纪80年代中期有关中国对虾的染色体研究才有相继报道，确定了染色体数目为88条（刘萍等，1987；相建海等，1988；Dai et al，1989；刘萍等，1992）。研究结果之不同是核型的分析上有所区别，戴继励等（1989）作出的核型为：2n554m120（m2sm）110sm14（sm2st），刘萍等（1992）作出的核型为：2n5 66m116sm1 6st。对于中国对虾染色体形态的描述，1992年刘萍等作了进一步的研究，发现正中期的分裂相有1对染色体存在次缢痕。

2.2.2　同工酶分析

中国对虾遗传多样性的研究直到20世纪90年代才有报道，刘旭东等（2001）建立了13种同工酶20个基因位点的遗传变异情况，认为中国对虾遗传变异水平较低。Wang等（2001）对中国对虾自然群体和养殖群体进行对比研究，认为所分析的12种同工酶编码的20个基因位点中，有4个是多态位点。数据分析结果表明，中国对虾群体杂合度在0.0.0　～ 0.033之间，证实了中国对虾群体遗传多样性低的结论。张志峰等（1997）检测了中国对虾各期幼体的8种酶的变化，发现EST、AMY、MDH、Gd等4种同工酶的酶带数和酶活性，均随着发育表现出明显的增多和增强。LDH的酶谱变化不大，除无节幼体外其他各期均为3条带，且表型一致。而ALP和ACP表现相对稳定，ALP为2条带，ACP为1条带。王金星等（1995）利用聚丙烯酰胺凝胶电泳对中国对虾健康虾与流行病病虾4种组织的蛋白质、EST、LDH和SOD等进行分析和比较。结果表明，肝胰脏和肌肉组织的蛋白质表型、肝胰脏中的EST和SOD的表型在健康虾和病虾之间存在着较明显的差异。认为肝胰脏内蛋白质代谢有明显的紊乱现象，这些同工酶的特异性变化可作为虾病早期诊断的辅助指标。

2.2.3　DNA分析

2.2.3.1　随机扩增多态DNA（Random Amplif ied Polymorphic DNA，RAPD）

对中国对虾进行群体遗传结构分析主要采用随机扩增多态DNA技术。石拓等（1999）对中国对虾朝鲜半岛西海岸群体共33个个体的基因组多态性进行了检测。利用20个随机寡核苷酸引物共检测105个位点，其中多态位点41个，占39%；个体间的平均遗传距离为0.093，群体的平均杂合度为0.2176，表明该对虾群体的遗传多样性较低。刘萍等（2000）对中国对虾黄、渤海群体的遗传多样性分析，表明黄、渤海群体多态位点数36.8%；对中国对虾黄、渤海群体为亲本与子一代两个家系的遗传多样性分析，表明家系A多态位点数17.95%，家系B检测多态位点数为20.45%。研究结果进一步证实，子代之间的遗传距离比其父、母与子代之间更小，遗传变异程度更低（刘萍等，2000）。石拓等（2001）对中国对虾的3个野生地理群体—朝鲜半岛西海岸产卵群体，越冬群体，黄、渤海中国沿岸群体和一个人工累代养殖群体进行了遗传多样性研究。4个群体的多态位点比例在20%～33.3%之间，群体内的遗传多态度为0.0.3　～ 0.0307。朝鲜半岛西海岸产卵群体及其越冬群体相近且高于黄、渤海沿岸群体，累代养殖群体遗传变异度最低。刘振辉等（2000）对中国对虾中国黄、渤海沿岸种群和朝鲜半岛西海岸种群的遗传多样性进行检测，结果显示两群体多态性片段的比例分别为36.49%和43.92%，朝鲜半岛西海岸种群的遗传多样性要比中国黄、渤海沿岸种群高，但两个种群都处于较低的遗传变异水平。

2.2.3.2　简单重复序列扩增多态性（Inter Simple Sequence Repeats，ISSR）(www.xing528.com)

ISSR技术建立于1994年，其引物包含几个碱基的简单重复序列，同时在39端或59端含有1～3个选择性碱基或锚定碱基，该技术利用引物的特性对基因组DNA进行选择性扩增，特异性地扩增出微卫星区域及其相邻区域DNA序列。王伟继等（2002）利用植物的ISSR引物，从100条引物中筛选了40条用于中国对虾ISSR分析研究体系，平均每条引物获得7.7个检测位点。实验中发现，获得较好实验结果大部分包含2碱基重复的引物，即在40个引物中占32条，另外3条是含3碱基重复的引物，其余类型的引物只占极少部分。

2.2.3.3　简单序列长度多态性（Simple Sequence Length Polymorphism，SSLP）

微卫星DNA是简单的短序列核苷酸串联重复，又称简单序列重复（Simple Sequence Repeats，SSR），广泛分布于基因组中，具有高度的多态性，信息含量丰富，其DNA指纹具有极高的个体特异性，符合孟德尔遗传模式，呈共显性表达，且具有片段小、易操作等特点而被广泛利用在各个领域。

徐鹏等（2001）利用PCR法从构建的部分基因组文库中筛选了含微卫星序列的克隆，获得了31个中国对虾的微卫星序列，并在GenBank中进行了序列注册。孔杰等（2002）在GenBank中注册了55个中国对虾微卫星序列，进行微卫星DNA标记的筛选。徐鹏等（2003）从10446个中国对虾ESTs数据库中筛选了229个微卫星序列，其中双碱基的重复序列3个，碱基重复序列58个，并根据筛选的微卫星序列设计合成了19对引物进行多态性检测，获得了8个中国对虾的微卫星标记。在这8个微卫星位点上，检测到的等位基因数从5个到15个不等。刘萍等（2004年）从构建的中国对虾部分基因组文库中筛选多态性微卫星序列，获得了8对多态性信息指数（PIC值）大于0.5的微卫星引物，并对中国对虾黄、渤海群体，朝鲜西海岸群体和韩国南海沿岸群体进行了遗传多样性分析，进一步证实了中国对虾黄、渤海沿岸群遗传多样性最低的结果。

2.2.3.4　扩增片段长度多态性（Amplif ied fragment length polymorphism，AFLP）

AFLP 技术又称为SRFA（Selective Restriction Fragment Amplif ication，选择性限制片段扩增多态性）。本技术在对虾类中，只在日本囊对虾和斑节对虾的连锁图谱中得到了应用（Moore et al，1999；Wilson et al，2002）。在中国对虾中未见公开报道。2003年岳志芹应用AFLP技术对中国对虾人工选育群体进行1～4个世代间遗传变异分析，结果表明，4代群体的多态位点比例分别为：39.43%、41.43%、33.43%和39.14%。AMOVA分析表明，86%的变异存在于群体内，各群体间的变异占总变异的8.31%，组间的变异只占4.97%；世代间遗传分化指数（Gst）在0.069.70　～ 0.1.1　54范围之间，说明4个世代选育群体之间存在一定程度的分化。