腹盆部肿瘤放射治疗学：肿瘤细胞损伤修复机制及检测

第四节　肿瘤细胞的犇犖犃损伤修复机制及检测

人体组织中的细胞始终保持着生长和死亡的动态平衡。在部分细胞发生自我凋亡或坏死的同时，另一部分细胞在不断地进行着增殖、分裂和分化。从而实现人体组织的更新和机体的新陈代谢。在细胞发生增殖和分裂前，核内的染色体DNA会通过核酸复制将其全部的遗传信息传递给子代细胞。然而在DNA复制过程中，其主导链和随从链会产生一系列的DNA断裂点，形成所谓的生理性DNA损伤。此外，某些环境因素如化学致癌剂、微生物毒素、氧自由基类体内代谢产物、烷化剂类抗肿瘤药物及离子射线等均能引起不同种类的染色体DNA损伤，造成单链DNA分子和（或）双链DNA分子的断裂。此时细胞将启用细胞核内的各种修复蛋白质，快速有效地修复上述的损伤DNA，以维持机体生物性状的遗传稳定性。研究表明，人体细胞中存在着:①直接修复（direct reversal）；②碱基切除性修复（base excision repair，BER）；③核苷酸切除性修复（nucleotide excision repair，NER）；④旁路修复（bypass damage repair）；⑤错配修复（mismatch repair）；⑥双链DNA断裂性修复等六大主要的修复通路。其中双链DNA断裂性修复途径又可分为非同源性末端连接修复（nonhomologous DNA ending joining，NHEJ）和同源性重组修复（homologous recombination repair，HRR）两大亚类。当然，在肿瘤放、化疗时人们有目的性地增加肿瘤细胞的各种DNA损伤，抑制其修复，以达到治疗肿瘤的效果。而在有些时候，人们应尽力避免与各种DNA损伤诱发因素的接触，促进人体细胞DNA损伤后的修复。以下就人体细胞内的六大主要修复机制作一简单的概述。

一、直接修复途径

它是通过一个简单的酶促反应，将某些碱基上的修饰基团用酶解的方法直接去除的一种修复方式。在染色体DNA分子中，鸟嘌呤有时可以发生甲基化修饰。修饰后的鸟嘌呤既可以与胞嘧啶配对又可以与胸腺嘧啶配对，可能造成DNA互补链上相应碱基的错配突变。细胞内的甲基鸟嘌呤甲基转移酶（MGMT）就负责将甲基化鸟嘌呤上的甲基基团转移到MGMT中的半胱氨酸残基上。此外，细胞内的相关碱性基团转移酶也可以通过上述类似的途径去除某些碱性核苷酸上修饰的碱性基团，以维持DNA双链分子结构和遗传信息的完整性。

二、碱基切除性修复途径

主要负责不同原因引起的损伤单核苷酸的分子修复。该类修复涉及细胞内的多种蛋白酶。整个修复过程包括损伤碱基的识别、切除、正常碱基的配对和DNA分子磷酸核糖骨架的连接。研究发现，细胞内有多种N－糖基酶，分别识别不同种类的突变碱基。这些N－糖基酶通常聚集在DNA双链分子的小弯处，并沿着磷酸核糖骨架作来回运动，以探测突变的碱基。当发现某个碱基发生突变时，细胞内特定的N－糖基酶首先水解突变碱基两侧脱氧核糖骨架上的两个糖苷键，切除受损的碱基，再利用无嘧啶或嘌呤（apurinic/apyrimidinic，AP）内切酶打开其中一条磷酸核糖基骨架侧链，在5′端切除一个磷酸脱氧核糖残基，造成DNA分子链上的一个断裂点，此时细胞核内的PARPs分子迅速与上述缺口结合，利用核质中的NAD＋分子，催化包括自身在内的下游系列靶蛋白及其聚合物的poly（ADP－ribose）修饰。修饰后的PARPs分子与DNA断裂点分离，并征用其他已活化的修复蛋白，如DNA聚合酶，按碱基配对的原则用正确的碱基替换被切除的突变碱基，再利用XRCC1/DNA连接酶Ⅰ或XRCC1/连接酶Ⅲ蛋白复合物连接断裂处的磷酸核糖基侧链。因此，突变碱基切除性修复是细胞内损伤DNA的一个无错性修复方式。

三、核苷酸切除性修复

它是人体细胞内最常见的、多功能损伤DNA修复方式。UV等引起的相邻嘧啶二聚体交联性损伤以及顺铂、苯并芘和细菌毒素引起的碱基加成性损伤均可借助该种修复方式加以矫正。核苷酸切除性修复与碱基切除性修复最大的不同在于前者在修复过程中需要切除一段包含损伤碱基在内的、长度为24～32bp不等的寡核苷酸片段，而后者只切除受损的单个碱基。因此，核苷酸切除性修复需要细胞提供较多的ATP，是一种较为耗能的修复方式。目前在人体细胞中已发现30多种不同的蛋白质参与了核苷酸切除性修复。由于这些蛋白质的生物学功能最早是在干皮症（xeroderma pigmentosum，XP）和Cockayne综合征（Cockayne syndrome，CS）患者的细胞中被发现和认识的，因此常称这类蛋白质为XP和CS因子。当细胞启动核苷酸切除性修复途径时，细胞核中的XPC因子首先识别受损的碱基，并与复制蛋白A（replication protein A，RPA）和XPA形成XPA－XPC－RPA蛋白复合物。其中，复合物中的RPA为单链DNA结合蛋白，通过与受损DNA链和完整DNA链的结合，适度打开并稳定受损碱基处的DNA空间结构，进一步吸引XPG和XPF等因子的参与；同时复合物中的XPA因子可与转录因子TFIIH结合，形成更大的蛋白复合物。TFIIH因子继而与XPB、XPD因子结合，形成由6～9个蛋白亚单位组成的、具有DNA解旋功能的蛋白复合物，进一步松弛碱基受损处DNA链的双螺旋结构。XPG因子属FEN－1蛋白家族成员，具有核酸内切酶活性，通过与RPA和TFIIH因子的结合定位于损伤DNA处，在受损碱基3′端的5～6个核苷酸处降解一个磷酸二酯键，形成第一个DNA链断裂点。与此同时，ERCC1－XPF蛋白质复合物可在受损碱基5′端的22～24个核苷酸处降解另一个磷酸二酯键，形成第二个DNA链断裂点，并成功切除一段长为24～32bp内含受损碱基的寡核苷酸片段。再在RPA、RFC、PCNA和DNA聚合酶δ/ε蛋白复合物的催化下，以对侧完整DNA链为模板、按碱基配对的原则填补寡核苷酸切除后所留下的缺口。最后由ATP依赖的连接酶Ⅰ连接寡核苷酸两端的两个磷酸二酯键，完成受损碱基的核苷酸切除性修复。

四、旁路修复途径

除了采用核苷酸切除性修复途径外，人体细胞尚可利用另一条被称为旁路修复途径来应对相邻嘧啶二聚体交联性损伤和化学物加成性损伤。通常受损DNA在细胞周期检查站被发现并启动适当的修复机制。若受损DNA没有得到正确的修复，细胞的增殖周期就会停止。然而旁路修复途径的一大特点是其容许细胞存在一定数量的损伤DNA，利用细胞核内的一些低保真度、易错性DNA聚合酶如DNA聚合酶τ和聚合酶ξ以较高的速率进行有错性DNA复制，从而使得整条染色体DNA的复制过程能顺利进行。研究发现，编码DNA聚合酶τ和聚合酶ξ的人体基因分别为hRAD30A和hRAD30B。在启动旁路修复途径时，人体细胞首先利用DNA聚合酶τ将错误的碱基插入到受损DNA链的对侧，继而利用DNA聚合酶ξ延伸核苷酸链。当然，在细胞发生分裂前，绝大多数上述错配碱基均会通过其他修复方式加以矫正，以维持染色体DNA遗传物质的稳定性。若少数错配碱基没有得到及时的纠正，染色体DNA就可能发生突变。因此，受损DNA的旁路修复途径是细胞内一个暂时的、有错性的修复方式。(www.xing528.com)

五、错配修复

染色体DNA在复制和重组过程中，时常会引入一些错配的碱基，这可能与某些DNA聚合酶的低保真性有关。然而细胞在DNA复制完成后终将去除这些错配的碱基，其中一个重要的修复途径就是错配碱基的修复途径。有关该修复方式的相关知识主要来自于对大肠埃希菌错配修复机制的研究。细菌体内MutS蛋白的同源二聚体首先识别DNA双链上的错配碱基，紧接着MutL蛋白与MutS蛋白相互作用形成一个蛋白复合物，激活MutH蛋白的核酸外切酶活性。活化后的MutH蛋白或从错配碱基的3′端或从错配碱基的5′端水解DNA分子骨架上的一个磷酸二酯键，形成一个Nick缺口，再从该缺口出发连续水解去除一个100～1 000不等的核甘酸片段。通过DNA聚合酶δ、RPA、PCNA和RFC等蛋白酶复合物的催化，用新合成的核苷酸链填补上述缺口。在DNA连接酶的作用下封闭断点，完成修复。由于在人体细胞中发现了细菌MutS和MutL的同源蛋白，因此，推测人体细胞也存在着碱基错配的修复途径。

六、双链DNA断裂性修复

多种因素可引起双链DNA分子的断裂性损伤，其中以离子射线的照射最为常见。在所有已知的DNA损伤类型中，双链DNA断裂是细胞内最为严重的一种损伤。它不仅直接引起染色体DNA的重组、缺失和扩增等突变，导致肿瘤的发生，而且会引起正常细胞的死亡和死亡类型的选择。在DNA分子中，互补链磷酸核糖骨架上的相邻或相近两个磷酸二酯键若同时发生断裂，即形成一个所谓的双链DNA断裂点。此时DNA分子的空间结构就无法得以维持，使断裂点两侧的DNA片段在空间上相互分离。这就存在着断裂DNA片段与染色体其他部位DNA分子重组和连接的可能性。此外，断裂点末端碱基常存在着某种坏损，使得细胞内双链DNA断裂很难被快速、无错性地修复。当染色体DNA出现断裂性损伤时，细胞会产生一系列生物化学和功能学上的改变。首先，细胞核内的ATM、ATR等蛋白激酶迅速与DNA断裂点结合并活化，通过催化下游靶蛋白如P53、CHK2、BRCA1和NBS1的磷酸化修饰，引起细胞G1/S期或G2/M期的停滞；其次，增加核糖核酸还原酶编码基因p53R2的转录，提高DNA合成所需的底物水平；再次，通过对染色体DNA重要组成成分H2AX组蛋白的磷酸化修饰，形成有利于损伤DNA修复的空间结构。研究发现双链DNA断裂性损伤修复通常涉及细胞内多种蛋白酶的参与，需经历一个较为复杂的酶触反应。非同源性末端连接修复（non－homologous DNA ending joining，NHEJ）和同源性重组修复（homologous recombination repair，HRR）是人体细胞中最主要的两条修复途径。

1.非同源性末端连接修复　当双链DNA断裂性损伤发生在细胞的G1/S期时，细胞常采用非同源性途径进行损伤DNA的修复。作为DNA的结合蛋白，细胞核内的Ku70和Ku80蛋白以核苷酸序列非依赖方式与断裂末端DNA结合。通过并列放置两个需修复的双链DNA片段，形成一个蛋白质/DNA开环式结构，同时松弛受损处DNA的双螺旋结构。结合在DNA链上的Ku蛋白继而与分子量为465 000的DNA－PKs分子相互作用，形成具有蛋白激酶活性的DNA－PK全酶复合物。DNA－PK是磷脂酰肌醇3磷酸（PIKK）蛋白激酶的家属成员之一，可催化下游诸如XRCC4及RPA等蛋白中丝/苏氨酸残基的磷酸化修饰，调控被修饰蛋白质的生物学功能。双链DNA断裂点末端的碱基通常存在着某些化学修饰，需经一定的剪切或合成加工，才能被连接。人体细胞中参与DNA断裂点末端碱基剪切加工的蛋白酶体系主要有MRE11－RAD50－NBS1蛋白质复合物和Artemis蛋白，两者同时具有核酸内切酶和外切酶的活性，可以切除不同长度的核苷酸片段。同时细胞中的DNA聚合酶β可合成和延伸双链DNA断裂点末端的核苷酸片段。因此，经过上述方式加工后的DNA片段末端往往会出现不同程度的核苷酸缺失或扩增，引入错误的DNA信息。最后，在Ku蛋白的介导下，细胞利用XRCC4－连接酶Ⅳ蛋白质复合物将两个断裂DNA片段的末端连接起来。这就是双链DNA断裂性损伤修复的经典途径。新近发现，人体细胞尚可启动PARP－1/XRCC3/连接酶Ⅲ等蛋白酶参与的备用途径以应对此类损伤的修复，但相关的修复机制目前还不太清楚。尽管非同源性末端连接性修复途径是一种有错性的修复方式，但它能迅速降低细胞内双链DNA断裂点的数量，避免细胞过度死亡或凋亡，为以后的精确修复赢得宝贵的机会。

2.同源性重组修复　是生物种系发育中一条较为保守的双链DNA断裂性损伤修复途径。当双链DNA断裂性损伤发生在G2/M期时，细胞往往采用同源性修复的方式来应对此类DNA损伤。参加同源性重组修复的主要蛋白酶有Rad50、Rad51、Rad52、Rad54、Rad55、Rad57、Rad59、Mre11和Nbs1等。在启动同源性修复途径时，细胞核内Rad50－Mre11－Nbs1组成的蛋白复合物首先与双链DNA断裂点末端核苷酸结合，凭借其5′→3′核酸外切酶的活性，切除损伤DNA末端处5′端的数个核苷酸，形成具有3′端尾链的突出结构。Rad51、Rad52、Rad54和RPA等蛋白陆续结合在3′端突出的尾链结构上，形成一个完整的蛋白酶复合物。借助复合物中Rad51蛋白对姐妹染色体完整DNA链的“扫描”及结合能力，发现并定位损伤DNA的同源片段。再在Rad51－Rad52－Rad54－RPA蛋白酶复合物的共同作用下，将受损的DNA片段插入到同源DNA双链分子中，并与其中一链DNA发生交换，形成一个D环结构。此时DNA聚合酶利用对侧互补链上正确的核苷酸信息，聚合、延伸和修复断裂DNA链上的受损碱基。然后细胞通过相关蛋白酶的作用，切除损伤DNA修复过程中形成的D环交联结构，再利用DNA连接酶Ⅰ将DNA断裂片段末端连接起来，完成双链DNA断裂片段的同源性修复。一般认为同源性重组修复是损伤DNA的一种无错性修复方式。然而当上述损伤发生在含有重复序列的DNA片段时，经同源性重组修复的DNA片段有时会缺失其中的1～2个重复片段，有时会插入一个无关的DNA片段。因此这种无错性修复方式是相对的。新近发现乳腺癌相关蛋白BRCA1及BRCA2可与Rad51蛋白相互作用，影响细胞的同源性修复，其详细的分子机制有待于进一步研究。

以上就人体细胞内存在的主要几种DNA损伤类型及其修复方式作一扼要的介绍。需特别指出的是同一细胞中不同类别的DNA损伤有时可以启用相同的修复方式，而相同类别的DNA损伤也可由不同的方式加以修复。细胞如何选择合适修复途径的分子机制目前尚不清楚，可能与细胞内损伤DNA的数量、种类，细胞周期，ATP能量供应状态和修复所需底物的浓度有关。现已证实人体细胞中某些DNA修复蛋白的突变和缺失会增加细胞自发性异常DNA的数量，增加细胞对化疗药物和放疗的敏感性，同时也增加细胞突变和肿瘤发生的可能性。由于引起染色体DNA畸变的因素多种多样，产生损伤DNA的种类繁多，因此用于损伤DNA修复研究的体内外观察方法也不尽相同。常用的有人工合成错配寡核苷酸双链的细胞内转导试验、特殊内切酶处理的质粒分析试验、双链DNA断裂片段的体外连接试验及体内酸性洗脱试验、双链DNA断裂片段的脉冲场电泳检测、卫星试验、同源染色体重组位点的免疫荧光试验以及姐妹染色体交换率检测等。由于篇幅的关系，本章节中不再详细展开。有兴趣的读者可参阅相关的书籍和文献。理解和熟悉人体细胞中损伤DNA的不同类型及其相关修复分子的机制，在临床医疗实践中有利于肿瘤科和放疗科医生自觉地采用不同DNA毒性药物的配伍治疗及放、化疗的联合应用，最大限度地增加肿瘤细胞对治疗的敏感性，减少正常细胞在治疗过程中的不良反应。

（吴伟忠）