蛋白质序列分析方法及重要性

蛋白质的氨基酸组分分析（composition analysis）和氨基酸序列分析（sequence analysis）是蛋白质研究的一项重要内容。

1.蛋白质的氨基酸组分 将6N HCl与纯化的蛋白质溶液混合，在真空容器中加热110℃并持续24小时，蛋白质或肽链可以分解成为单个氨基酸。利用离子交换层析法将各个组分分离开，然后根据测定的量计算出每种氨基酸在该蛋白质中的百分比组成。

2.蛋白质的N-端和C-端的氨基酸 利用二硝基氟苯与多肽链的α-氨基作用生成二硝基苯氨基酸，然后将多肽链水解，分离出二硝基苯氨基酸，并确认其氨基酸种类。可以利用羧肽酶将羧基端氨基酸从多肽链上水解下来，并确认其种类。

3.Edman降解法 首先将肽链与异硫氰苯酯反应。该试剂只与肽链N-端的氨基酸的α-氨基反应，生成异硫氰苯酯衍生物。在冷稀酸条件下，该异硫氰苯酯衍生物可从肽链上脱落下来，而肽链上的其他部分保持完整不变（图1-42）。用层析法确定出脱落的氨基酸种类，即肽链N-端的氨基酸。残留下的肽链N-端的α-氨基可以继续与异硫氰苯酯反应，重复以上的步骤，可以确定出肽链N-端起的第二个氨基酸的种类。以此类推，循环使用该方法可以依次地确认出从氨基末端起始的氨基酸序列（图1-43）。该方法称为Edman降解。

图1-42　测定氨基末端氨基酸的异硫氰苯酯反应

Edman降解法不能无限制的重复。对一个较大的蛋白质进行氨基酸测序时，一般需要先用特定的裂解剂将其分解成多个肽链片断，然后利用Edman降解法对每一个肽链片段进行测序。为了能够准确地确定出肽链片断的连接顺序，一般需要利用几个具有特异性裂解位点的裂解剂来完成。在得到每一组肽链片断的氨基酸序列后，通过排列组合，最后确定出该蛋白质完整的氨基酸序列（图1-44）。表1-6列出了几种常用的裂解剂以及它们的肽链切点。

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图1-43　利用Edman降解法确定蛋白质氨基酸序列的示意图

图1-44　利用多次裂解、分段测序和排列组合法确定大分子蛋白质氨基酸序列的示意图

表1-6　用于裂解蛋白质和肽链的生物酶和化合裂解剂

*表中的（C）和（N）表示该酶在指定的氨基酸的C-端或N-端进行酶切

4.其他方法 根据已知的DNA序列，人们可以按照三联密码原则推演出蛋白质的氨基酸序列（见第十二章）。此外，蛋白质的氨基酸序列还可以通过质谱方法（mass spectroscopy）来确定。