废水生物处理中氨氧化细菌浓度快速测定方法

一、实验目的

了解实时荧光定量PCR 的实验原理；了解Taqman探针法定量原理及SYBR Green定量的原理；了解绝对定量和相对定量的原理；学习并掌握绝对定量的标准品制备方法及定量PCR 实验的操作规程。

二、实验原理

实时荧光定量PCR（real time quantitative PCR）技术是美国Applied Bisystems公司于1996年推出的一种核酸定量技术。该技术是在PCR 反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的累积实时监测整个PCR 进程，最后通过标准曲线或内标基因对未知模板进行定量分析的方法。与常规PCR 相比，它具有特异性更强，能有效解决PCR 产物污染，自动化程度高，对模板准确定量等特点。实时荧光定量PCR 敏感性通常达100copy／mL，且线性范围宽，重复性好。在实时荧光定量PCR 中，以PCR 循环数（Cycle）为横坐标，以每个循环收集的荧光强度为纵坐标得到一条S形曲线，这条曲线称为扩增曲线（图7-5）。在扩增曲线的指数增长区域内适当位置上设定一个荧光检出界限，这个限值即为荧光阈值（threshold）。Ct值的确定与荧光阈值的设定密切相关，一般来讲，PCR 起始的前3～15个循环的荧光信号变化不大，接近一条直线，也称为基线，是由于测量的偶然误差引起的。荧光阈值的默认设置是3～15个循环荧光信号标准偏差的10倍。实时荧光定量PCR 扩增过程中，每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数，即扩增曲线与阈值线交点的横坐标，称为Ct值（C代表Cycle，t代表threshold）。Ct值是一个很重要的概念，在PCR 的指数扩增区域内，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。以起始拷贝数的对数值为横坐标，Ct值为纵坐标，可制作一条已知起始拷贝数的标准品和Ct值的关系的标准曲线，根据标准曲线和未知样品的Ct值即可计算出未知样品的起始拷贝数。

图7-5　实时荧光定量PCR 的扩增曲线图

一个理想的PCR 反应，反应每进行一个循环，PCR 产物量增加一倍，即为之前的2倍。n 个循环后，产物量理论上应为原来的2的n 次方倍，即：

X=X0×2n

式中　n——扩增反应的循环次数；

　　　X——第n 次循环后的产物量；

　　　X0——初始模板量。

实际PCR 反应中由于存在多种因素影响PCR 的进程，使PCR 没有按理想的方式进行，这就需要引入扩增效率的概念，扩增效率（Efficiency）指每经过一轮循环，目的产物量增加了多少，用百分数或小数表示均可。非理想状态的产物浓度可按下式计算：

X=X0（1+E）n

式中　n——扩增反应的循环次数；

　　　X——第n 次循环后的产物量；

　　　X0——初始模板量；

E——扩增效率。

可见，扩增效率越接近1，反应越接近理想的PCR 反应。所以定量PCR 实验中，扩增效率是一个非常重要的参考值，一般扩增效率为80%～120%，越接近1，越理想；过高或过低的扩增效率说明PCR 反应偏离理想实验过多，定量结果不准确。一般而言，效率低于100%，可能是由于PCR 反应体系中存在抑制PCR 反应的因素，而高于100%，可能是由于污染，非特异性扩增或引物二聚体造成的。

1.荧光定量的原理

根据使用的荧光类型，实时荧光定量PCR 可分为两大类：荧光染料法和荧光探针法。荧光探针法主要包括：TaqMan探针、分子信标、蝎型探针等，其中TaqMan探针是应用相对较多的类型。荧光染料法应用的染料主要是SYBR Green Ⅰ。下面介绍两种主要的类型，即TaqMan探针和SYBR Green Ⅰ的定量原理。

（1）TaqMan探针法的定量原理

TaqMan探针为寡核苷酸，5′端标记一个报告荧光基团（Reporter），3′端标记一个淬灭荧光基团（Quencher）。

TaqMan探针法定量时，反应液中加入了一对引物和一条特异性的寡核苷酸荧光探针，探针的5′端标记了一个报告荧光基团，3′端标记了一个淬灭荧光基团。探针完整时，由于淬灭荧光基团与报告荧光基团离得很近，报告荧光基团发射的荧光被淬灭荧光基团所吸收，引物退火时，探针结合到目的基因片段上；延伸反应时，具有5′→3′核酸外切酶活性的Taq酶将探针降解为核苷酸，此时报告荧光基团与淬灭荧光基团分离，荧光检测系统接收到荧光信号。每扩增一条DNA链，就有一个探针被降解，有一个荧光分子形成，从而实现了荧光信号的累积与PCR产物的形成完全同步，产生的荧光分子数与PCR产物的数量成比例。因此，根据反应中荧光强度即可计算出初始模板的数量。TaqMan 探针的定量原理如图7-6所示。

图7-6　TaqMan探针的定量原理

（2）SYBR Green Ⅰ荧光定量原理

SYBR GreenⅠ是一种可以与所有双链DNA 双螺旋小沟区域结合的具有绿色光激发波长的染料。当它与DNA 双链结合后，荧光信号增强为原来的20倍以上；双链DNA 解链时，染料从DNA 上释放出来，荧光信号急剧减弱，因此荧光信号的强度与双链DNA 分子数量相关，因此根据延伸后的荧光强度可以监测PCR 的进程（图7-7）。由于SYBR Green Ⅰ可以与所有的双链DNA 分子结合，所以反应中如存在目的片段以外的双链DNA，如非特异性扩增产物、引物二聚体等，会对定量的结果产生影响，产生假阳性或使定量结果偏高。但可以通过溶解曲线分析，优化反应条件，得到更为准确的定量结果。相对于TaqMan探针而言，SYBR Green Ⅰ具有对DNA 模板没有选择性、使用方便、灵敏度高、价格便宜等优点；缺点是对引物特异性要求高，易产生假阳性结果。

图7-7　SYBR Green Ⅰ的定量原理

SYBR Green Ⅰ法定量时每次都要进行熔解曲线分析，根据熔解曲线的结果判断实验结果是否可信。熔解曲线分析是通过对PCR 产物加热，随着温度的升高，双链扩增产物逐渐解链，导致荧光强度逐渐下降，当到达某一温度时，大量的PCR 产物解链，荧光急剧下降，这个温度即为PCR 产物的熔解温度（Tm）。利用该特点以及不同PCR 产物的Tm 值不同，可对PCR 的特异性进行鉴定。

下面列举了几种常见的熔解曲线分析结果：样品熔解曲线是单一峰，且无模板对照的熔解曲线无明显峰，说明PCR扩增产物单一且无引物二聚体，此时定量结果准确（图7-8a）；样品熔解曲线有两个以上的峰，说明PCR反应过程中有非特异性扩增，此时定量不准确，需要优化反应条件（图7-8b）；样品熔解曲线是单一峰，但是无模板对照的熔解曲线也有峰，且出峰的温度低于样品的熔解温度，说明有引物二聚体存在，此时定量也不准确，需要优化反应条件（图7-8c）。

图7-8　熔解曲线分析

2.绝对定量和相对定量

根据定量方式不同，实时荧光定量PCR 可分为绝对定量和相对定量。

（1）绝对定量

绝对定量就是用一系列已知浓度的标准样品制作标准曲线，曲线的横坐标是基因的拷贝数，纵坐标是Ct值。在定量标准曲线的同时，扩增未知样品，根据未知样品的Ct值和标准曲线，计算出未知样品的目的基因起始拷贝数。标准样品可以是含有和待测样品相同扩增片段的克隆质粒、纯化后的PCR 产物、cDNA 或体外合成的单链DNA，用紫外分光光度计或荧光酶标测定标准品浓度，再根据质粒或cDNA 分子量换算成拷贝数，进行系列稀释即可制作标准曲线，定量PCR 实验中常用5倍或10倍系列稀释。这一方法的动力学范围广，可以达到9个数量级。制作标准曲线一般取五个点，每点做三个平行样，浓度范围要能覆盖样品的浓度区间，以保证定量的准确性。对于长期稳定使用的标准品也可以适当减少重复的次数，有研究表明，质粒型标准品稳定性好，不易降解，实验中可以长期反复使用，但若存放过久，如6个月以上，仍建议重新测定质粒浓度；而其他类型的DNA 都是线性片段，稳定性差，一般使用14天以上要重新测定浓度。克隆质粒的获得，可以用纯培养的模式菌种作为出发菌株克隆目的片段。如果没有模式菌株，也可以用混合样品的DNA 作为模板克隆目的片段，再测序确认即可。

一条理想的定量PCR 标准曲线要满足以下条件：基线平整，无模板对照（No Template Control，NTC），无明显扩增，指数期明显，各样品的平台区汇于一起，线性范围宽。拟合优度（R2）大于0.98，越接近1，结果可信度越高。扩增效率（E）0.8～1.2，越接近1，越理想。

（2）相对定量

相对定量就是在定量目的基因的同时定量看家基因的浓度，以内参基因的表达量来表示目的基因表达的情况，一般利用相对定量的方法分析目的基因的表达情况。在RNA 分析时，由于提取RNA 的得率不同、RNA 反转录为cDNA 的效率不同等客观因素，绝对定量得到的拷贝数并不能很好地说明细胞内RNA 的实际情况。因此，在进行基因表达调控研究中会用一些看家基因来标准化目的基因的表达情况，以校正因样品初始浓度不同而造成的差异。这些用来标准化目的基因的看家基因就称为内参基因。常用的看家基因有βactin，GAPDH，18SrRNA 等。相对定量方法有两种，即比较Ct法（Delta-deltaCt，ddCt或ΔΔCt）和相对标准曲线法，这些方法定量的结果均用样本间目的基因表达量的倍数关系来表示。运用相对定量时，首先要用梯度稀释的目的基因和内参基因作两条标准曲线比较它们的斜率，若两组标准曲线扩增效率基本相仿，那么后续实验中就可以用ddCt法；若差异较大（斜率差大于0.1），则只能选用相对标准曲线法。ddCt法中，样品与对照的目的基因的Ct值变化量用ΔCt，q表示，样品与对照的内参基因的Ct值变化用ΔCt，cb表示，则-ΔΔCt=-（ΔCt，q-ΔCt，cb），2-ΔΔCt表示实验组目的基因的表达量相对于对照组的变化倍数。ddCt法的一大特点是，当优化的PCR 体系建立后，在每次实验中无须再对看家基因和目的基因作标准曲线，而只需对待测样品分别进行PCR 扩增即可；每次实验都默认目的基因和看家基因的扩增效率一致，而并非真实扩增情况的反映，因此实验条件需要严格优化。这种方法对于样品量大，但研究的基因数目相对较少的情况特别有用，因为一旦实验条件优化好后就无须再作标准曲线，节约了试剂材料成本，实验操作也相对简单。

目的基因和内参基因的扩增效率不一致时使用相对标准曲线法定量。这种方法考虑了不同基因扩增效率的差异，用标准曲线来校正扩增效率。这里制作标准曲线的标准品可以是任何含有目的基因和内参基因的cDNA，不需要知道浓度，只要知道稀释倍数。未知样品根据标准曲线计算浓度值，将目的基因的值除以内参基因得到一个比值，再选择一个参照，如未处理样本对照，所有样本的比值除以参照的比值，计算结果即为表达的倍数关系。

用双标准曲线法做相对定量分析，无须像ddCt法那样对实验进行严格的优化，但每次实验都必须对目的基因和看家基因作两组标准曲线。相对标准曲线法，适合于样本量不大，但研究的基因较多的情况。

下面我们以SYBR Green Ⅰ法绝对定量未知样品中氨单加氧酶为例来说定量PCR 实验具体如何操作。

三、实验条件

1.仪器设备

PCR 仪，超微量分光光度计Nanodrop2000，凝胶成像仪，电泳仪，水平电泳槽，恒温摇床，恒温培养箱，定量PCR 仪，单道可调微量移液器，台式高速离心机，离心管，Tip 头，1.5mL离心管，光学8联管等。

2.试剂与样品

TaqDNA 聚合酶，dNTP，上下游引物，无菌水，琼脂糖，lodding buffer，EB 溶液，TAE电泳缓冲液，胶回收试剂盒，pMD-18T 载体，T4连接酶，LB 液体培养基，LB 固体培养基，100mg／mL 氨苄西林溶液，质粒小量提取试剂盒，SYBR Green Ⅰ定量试剂盒等。

定量氨氧化菌的氨单加氧酶基因的引物为：amoA-F：5′-GGGGTTTCTACTGGTGGT-3′；amoA-R：5′-CCCCTCKGSAAAGCCTTCTTC-3′。

样品为纯化的活性污泥总DNA。

四、实验步骤

1.标准质粒的制备

（1）以活性污泥DNA 为模板，以amoA-F 和amoA-R 为引物，PCR 扩增目的氨单加氧酶基因，扩增条件：95℃3min；95℃15s，52℃30s，72℃1min，30cycles，72℃5min，目的片段465bp，按试剂盒操作说明胶回收纯化目的PCR 产物。

（2）胶回收产物与pMD18T 载体于1.5mL 离心管中按表7-5配制连接体系，室温过夜连接，置4℃保存备用。

表7-5　连接体系的配制(www.xing528.com)

（3）大肠杆菌感受态细胞的制备

挑取E.coli Top10单克隆菌落，接种到装有1mL LB液体培养基的1.5mL离心管中，37℃160r／min 过夜培养。取400μL培养液接种到盛有40mL LB液体培养基的250mL三角瓶中，37℃160r／min培养90min（OD600≈0.6），取出置冰上30min，倒入预冷的无菌50mL离心管中，4℃6 000r／min离心5min，弃上清，加入20mL 预冷的0.1mol／L 氯化钙溶液，悬浮菌体，冰上放置30min。4℃6 000r／min离心5min，菌体在离心管底形成一白色圈，此时的菌体沉淀非常松散，小心地倒掉上清液，注意不要把菌体倒出。加入1mL预冷的0.1mol／L氯化钙溶液，于冰上摇匀，置冰上于4℃保存备用（使用期限约一周）。

（4）连接产物转化大肠杆菌感受态细胞

取100μL感受态细胞加入含有10μL连接产物的离心管中，冰上放置30min，42℃热激90s，迅速置于冰水混合物中2min，加入1mL LB液体培养基，37℃160r／min培养1h，取200μL均匀涂布于含60μg／mL氨苄西林的LB平板，37℃倒置培养过夜，挑取平板上长出的单克隆菌落至500μL含60μg／mL氨苄西林的液体LB中，37℃160r／min培养5～8h。

（5）转化子鉴定

取1μL培养物为模板，用M13引物或amoA 引物PCR 扩增，琼脂糖电泳，产物片段大小与插入目的片段大小相同的即为阳性转化子。选择2个阳性转化子送样测序。测序结果与插入的目的基因序列比对，正确的阳性的转化子即为含有标准质粒的菌株，保存菌种备用。

（6）标准质粒的提取及浓度换算

取20μL含有标准质粒的菌株的菌液（或挑取单克隆菌落）转接到3mL 含60μg／mL氨苄西林的LB液体中过夜培养12～16h。按质粒小量提取试剂盒操作说明抽提质粒DNA，Nanodrop 2000测定质粒DNA 浓度，按如下公式换算为拷贝数浓度，即得已知拷贝数的标准质粒。

式中　W——DNA 的质量浓度，g／μL；

　　　DNA 碱基数——质粒DNA 的碱基数量；

　　　660——每对碱基的平均分子量。

2.定量环境样品中氨单加氧酶基因浓度（以氨单加氧酶基因的浓度来表示氨氧化菌的活力）

（1）标准质粒的梯度稀释

将已知拷贝数的质粒pMD-amoA 稀释到浓度为108copies／μL。取4个1.5mL 的离心管，分别标记107，106，105，104，向每管加入90μL 双蒸水，取10μL 108copies／μL的标样加入107管中，充分混匀后，按上述操作继续稀释，注意每次均要更换Tip头。梯度稀释的准确程度直接关系到标准曲线的斜率和相关系数R2的值，务必严格按要求操作。

（2）定量PCR 反应体系

标准的定量PCR 实验推荐反应体系是50μL，为了节约实验成本，经实验摸索后发现用20μL反应体系也可以得到稳定的实验结果，所以推荐用20μL反应体系，可以按表7-6配制反应体系。

表7-6　定量PCR 反应体系配制

（3）预混液的制备

实验中需要作一条5个点的标准品曲线、一个无模板对照和一个未知样品，总计7个样品，每个样品3个平行样，则需要21个反应管，为了弥补分装的损失，按1∶1.25比例扩大反应预混液的体积，按表7-7比例配制。

表7-7　预混液配制

（4）预混液的分装及添加模板

取7个0.2mL 离心管，每管分装63μL 预混液，在每管中分别加入7μL 上述的模板（梯度稀释的标准质粒、未知样品），无模板对照里加入7μL无菌水。

（5）分装

将上述7个已加入模板的反应液充分混匀后分别按每管20μL分装到8联管的三个反应管中，盖上盖子。

注意：96孔板式加热的定量PCR 仪器易受荧光物质污染（如ABI7500），操作中要注意避免污染8联管的管壁，从而减少对仪器的污染。

（6）上机，设置软件参数运行

8联管低速离心后按顺序放置到定量PCR 仪里，按表7-8条件设置仪器运行参数，在每个循环结束时，即60℃后检测荧光值。

表7-8　定量PCR 运行参数

溶解曲线分析：60℃～95℃，逐渐升温，每升高一摄氏度检测一次荧光值。待程序运行结束后用软件分析定量及溶解曲线的结果。

设置样品表，选择样品类型，标准样品要设定已知的拷贝浓度，待测样品设为未知样品，阴性对照设置为NTC，标明平行样品。

五、实验结果与数据分析

1.实验数据记录

记录实验日期，详细实验步骤及仪器运行参数。

2.实验数据处理

软件分析实验结果，观察标准曲线是否符合基本要求，即R2≥0.98，E0.8～1.2；观察熔解曲线以确定定量结果是否准确。

3.参考实验结果图（图7-9，图7-10）

图7-9　扩增曲线

六、问题与讨论

1.SYBR Green Ⅰ法实验中，为何每次实验都要进行溶解曲线分析？

2.什么是绝对定量？一条理想的标准曲线要满足哪些条件？用于标准曲线制作的标准样品有哪些类型，什么类型的DNA 作为标准样品最佳？

3.如何根据溶解曲线来判断实验结果是否准确？对于不同情况导致的结果不准确分别要怎么解决？

图7-10　熔解曲线

七、注意事项

1.仪器运行程序设置时，务必要注意是否已经设置了获取荧光值。

2.从严格意义上讲，绝对定量每次样品的检测都要作标准曲线，因为每次实验的扩增效率可能会有所不同。如果能保证每次的扩增效率一致，也可以将基因的标准曲线先制作完成，做样品检测时只要将标准曲线的斜率和截距直接导入就可以重复使用。对于样品很多，目的基因很多的情况，这种做法能提高实验效率节约试剂费用。严谨起见，在样品测定时，可以同时测定1～2个标样，如果标样的Ct值与作标线时该标样的Ct值偏差小于0.5，就可以放心使用这条标线；如果偏差过大则不建议使用。

3.标准品稀释和加入模板后均要充分混匀，对于低浓度时尤为重要。建议用移液器反复吹打或手指轻弹管底混匀，静置1～2min，以使DNA 分子在溶液中充分扩散。

4.实验人员的手上可能会沾染荧光物质，一旦引入实验体系会导致实验结果不准确，所以在定量PCR 实验操作中，特别是在接触光学8联管和使用定量PCR 仪时，要戴干净手套。

5.实时荧光定量PCR结果的好坏往往取决于DNA 的纯度，DNA 中如果含有抑制PCR反应的物质会导致定量结果不准确，所以需要纯度较高的DNA。若怀疑DNA 中污染有PCR抑制剂，可采用十倍稀释DNA 后定量PCR检测，观察定量结果与稀释度是否吻合。如果有PCR抑制剂，稀释后DNA 的定量结果乘以十则必定大于DNA 原液的定量结果。