分析实验：PCR扩增16SrDNA并琼脂糖凝胶电泳

一、实验目的

学习PCR 扩增原理；了解PCR 扩增过程中各因素对扩增结果的影响；掌握PCR 扩增实验的操作方法；学会利用琼脂糖凝胶电泳法分析PCR 扩增结果及实验可能存在的问题。

二、实验原理

PCR 是聚合酶链式反应的简称，也可称为DNA 体外扩增技术。PCR 是以单链DNA为模板，4种dNTP为底物，在模板3′末端有引物存在的条件下，用DNA 聚合酶进行互补链的延伸。

1.PCR 循环

图7-2　PCP技术原理

PCR 循环一般分为变性（Denature），退火（Anneal），延伸（Extension）三个基本步骤（图7-2）。变性是指模板双链DNA 片段在高温时碱基对间的氢键断裂，DNA 双螺旋结构解体，由双链变成单链。退火指特异性寡核苷酸引物在适当温度下与单链模板上的目的DNA 序列互补结合。由于引物浓度较高，长度较短，在适宜温度下，引物与模板互补结合的速度要比两条模板链重新形成双链的速度快。延伸是指DNA 模板-引物结合物在DNA 聚合酶的作用下，以dNTP（四种脱氧核糖核苷三磷酸混合物，即dATP、dTTP、dGTP和dCTP的混合物）为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对原则，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链的过程。目前常用的DNA 聚合酶是Taq DNA 聚合酶，这种酶能耐受长时间高温，最适温度是72℃，在最适条件下每个酶子每分钟可以合成约1 000 bp的DNA。

重复变性-退火-延伸的过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。理论上，每增加一个循环，目的DNA 分子数就扩大一倍，即以指数方式增加。实际上，经历约25个循环以后，PCR 反应条件逐渐恶化（扩增产物的积累，引物及dNTP浓度的逐渐减少，DNA 聚合酶活性的降低等），PCR 产物趋于饱和，反应进入平台期，非特异性扩增产物逐渐增多。对于环境样品而言，为了降低非特异性扩增及PCR 反应偏好性的影响，一般采用25～30个循环为宜。

2.PCR 反应必备五要素

PCR 反应必须具备的五要素是引物，dNTP，DNA 聚合酶，模板与镁离子。

（1）引物

引物是PCR 特异性反应的关键。反应中，每条引物的浓度一般为5～100pmol／L，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会，浓度过低则合成产物量减少。一般根据合成引物的nmol数加适当体积无菌超纯水将引物稀释为100mmol／L的储存液，再稀释十倍得到10mmol／L的使用液。50μL反应体系中加入1μL使用液即可。引物设计原则：长度一般15～30bp，常用18～27bp，有效长度不能大于38bp；序列Tm 值（Tm 值就是DNA 熔解温度，指DNA 的双螺旋结构降解一半时的温度）一般控制在55℃～60℃，尽可能保证上下游引物的Tm 值一致，一般相差不超过2℃；有效引物中（G+C）的比例为40%～60%；引物间无3′端互补、二聚体或发夹结构；引物3′端最末及倒数第二个碱基要求严格配对；引物3′端最好不用T，因为末端为T 时，在错配的情况也能引发新链的合成，引物3′端的最佳碱基选择是G 和C，因为它们形成的碱基配对比较稳定；引物应与核酸序列数据库里除目的序列外的其他序列无明显同源性。

（2）dNTP

dNTP的质量与浓度和PCR 扩增效率有密切关系。dNTP 很不稳定，多次冻融会使dNTP降解，保存不当其易变性失活。在PCR 反应中，常用的dNTP 浓度为20～200μmol／L，使用浓度高低取决于扩增片段的长短，扩增的片段长，需要的dNTP多，反应中四种dNTP的浓度要相等（等物质的量）。过高或过低的dNTP 浓度都对PCR 反应不利，dNTP浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低扩增产物产量。实验中常用的dNTP浓度为每50μL反应体系中加入0.5μL 10mmol／L each的dNTP使用液。

（3）DNA 聚合酶

DNA 聚合酶对复制精确性影响较大，常用的Taq DNA 聚合酶由于没有3′→5′核酸外切酶活性，所以对合成的碱基没有校对作用，复制精确性较低。一些具有3′→5′核酸外切酶活性的DNA 聚合酶则复制精确性较高，PCR 产物的突变率低。典型的PCR 反应约需DNA 聚合酶量0.5～2.5U／50μL，酶浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则不能得到足够的扩增产物。

（4）模板

单、双链DNA 均能作为模板，每个PCR 反应中加入的模板数量可在102～105分子间变化，必要时可低至50个分子。模板加入量不宜过多，加入过多的模板实际上也引入了多余污染物，难于得到纯净的DNA，当扩增产物不理想时，减少模板用量会得到意想不到的效果，而且模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。

（5）镁离子（Mg2+）

Mg2+浓度与DNA 的解链温度、产物特异性及忠实性、引物二聚体的形成、酶活力及产物产量等因素有关。PCR 反应中使用的游离Mg2+浓度为0.5～2.5mmol／L，但dNTP、模板与产物DNA、引物、EDTA 都会与Mg2+结合，所以Mg2+的加入量要考虑这些物质的浓度。一般PCR 反应中，当dNTP浓度为200μmol／L 时，Mg2+浓度为1.5～2.0mmol／L 为宜。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，Mg2+浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。Mg2+浓度与PCR 反应成功与否关系密切，必要时可考虑按不同浓度加入Mg2+，寻找出其反应最适浓度。

除上述PCR 反应五要素外，必要时，可以在反应体系中加入一些PCR 添加剂。加入酶保护剂，如甜菜碱、小牛血清蛋白（BSA）、明胶或二硫苏糖醇（DTT），对扩增长片段或需时较长的PCR 反应效果明显。对于扩增长片段或高GC 含量的片段时，可加入甜菜碱、二甲亚砜、甘油或甲酰胺以降低DNA 变性温度。加入四甲基氯化铵能增加引物与模板配对的严格性，能提高PCR 效率和反应特异性。加入Tween 20会减少可能存在的阴离子去污剂对酶的抑制作用。添加剂的用量不宜过高，一般2%（v／v）即可。有些添加剂浓度过高还会抑制PCR 反应，如二甲亚砜达5%时即可抑制PCR 反应，所以PCR 添加剂在不同反应体系中的用量应通过实验来调整和合理选择，合理准确的使用会使一些难以进行的PCR 反应获得很大改善，得到试验所需要的理想结果。

3.琼脂糖凝胶电泳

琼脂糖凝胶电泳是分离纯化DNA 最常用的实验技术。琼脂糖是从琼脂中提取的聚合长链分子，能形成具有刚性的凝胶，凝胶孔径的大小与凝胶的浓度有关，浓度越大孔径越小。DNA 分子带负电荷，电泳时由负极向正极泳动，在分子筛效应影响下，DNA 分子根据分子质量大小及构型的不同，形成不同的DNA 条带。DNA 在凝胶中的迁移速度与其相对分子质量的对数值成反比。溴化乙锭（EB）是一种扁平分子，带正电荷，电泳时从正极向负极泳动。电泳时，DNA 分子与EB相遇结合形成EB-DNA 复合物，该复合物在紫外光下显橙红色荧光，其荧光强度与DNA 的含量成正比。电泳后，DNA 可分出不同的区带，达到分离、鉴定和提纯DNA 片段的目的。用已知片段大小和浓度的分子质量标准物作参考，根据条带的相对位置可粗略估计样品DNA 的片段大小，根据条带的荧光亮度可粗略估计样品DNA 的浓度。

本实验以PCR 扩增水样总DNA 中的16SrDNA 为例，学习PCR 的原理和一般操作过程，以大肠杆菌DNA 作阳性对照，以无菌水作阴性对照。学习用琼脂糖电泳判定PCR 扩增成功与否，并学会用琼脂糖电泳图分析实验中可能存在的问题。

三、实验条件

1.仪器设备

PCR 扩增仪，单道可调微量移液器（2.5μL、10μL、100μL、1 000μL），电泳仪，水平电泳槽，凝胶成像仪，1.5mL离心管，0.2mL薄壁管，无菌Tip头。

2.试剂与样品

（1）模板DNA：水样总DNA 和大肠杆菌（E.coli）总DNA。

（2）Taq DNA 聚合酶及其缓冲液：商品化的Taq DNA 聚合酶均配有10×Buffer，有的Buffer里面含有1.5mmol／L MgCl，没有的需要自己另行加入，使用前注意查看说明书。

（3）dNTP：2.5mmol／L each，dATP、dCTP、dGTP、dTTP浓度均为2.5mmol／L。

（4）引物：选用扩增16SrDNA 上V3区的引物，扩增产物大小约200bp，引物名中的数字是大肠杆菌16S rDNA 碱基编号的序号，引物名及序列分别为：338F：5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′；518R：5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′。

（5）琼脂糖。

（6）50×TAE 电泳缓冲液（pH=8.5）：每1 000mL 含Tris 242.0g，NaAc 57.1mL，Na2EDTA·2H2O 37.2g。使用时稀释100倍。

（7）6×Lodding Buffer：0.25%溴酚蓝，36%蔗糖，0.6% Tris碱。

（8）溴化乙锭的配制：称取0.1g溴化乙锭，溶于10mL 水，配成终浓度为10mg／mL的母液，于棕色瓶中保存。溴化乙锭为强致癌剂，使用时务必小心。可用无毒害的GelRed替代溴化乙锭。

（9）DNA Marker：可选用TaKaRa的DL2000。

四、实验操作(www.xing528.com)

1.预混液的配制

取一个1.5mL离心管，按表7-1用量，根据样品数计算出各试剂的加入量（本实验中模板仅为水样总DNA、E.coli总DNA，加上一个阴性对照，共计需要3个反应管，由于管壁吸附等损耗，预混液按4个反应体系配制），依次加入无菌水、10×buffer、dNTP、上下游引物、Taq DNA 聚合酶（注意：不加模板DNA），用微量移液器轻轻混匀（不要产生气泡）。

表7-1　PCR 反应体系的配制

2.分装

每个无菌0.2mL薄壁管中加入24μL预混液。

3.加模板

在上述已加入预混液的薄壁管中分别加入1μL 的水样总DNA、E.coli 总DNA（阳性对照）、无菌水（阴性对照），做好标记。

4.打开PCR 仪，按下述条件设置扩增程序，运行。

94℃3min→94℃30s，55℃30s，72℃40s（30个循环）→72℃5min→15℃

运行结束后，关闭PCR 仪，取出样品，PCR 产物于4℃或-20℃保存备用。

5.制胶

配制质量浓度约为1%的琼脂糖凝胶，称取琼脂糖0.2g，加入20～25mL 0.5×TAE，微波加热至完全溶解，待冷却到约50℃，加入EB（EB 是致癌剂，操作中注意戴好防护手套），终浓度0.5μg／mL，轻轻摇匀，倒入放有制胶板的制胶器中，插上梳子凝固待用。

6.点样

待凝胶完全凝固，轻轻拔出梳子，拿制胶板的两侧将凝胶从制胶器中取出，连制胶板一起放入电泳槽中，加入0.5×TAE至淹没凝胶，5μL PCR 产物与1μL 6×lodding buffer混匀后加入加样孔中，在一个空孔中加入4μL DL2000 Marker，记录点样次序和加样量，注意Tip头不要扎破胶孔边缘的凝胶。

7.电泳

连接电泳槽电极导线，点样孔端接负极，另一端接正极，打开电源，调电压至8～12V／cm，电泳30min左右，当溴酚蓝移到距胶孔2～4cm 时，停止电泳。

8.观察电泳结果

取出凝胶，在凝胶成像仪的托板上将凝胶从制胶板中倒出，312nm 波长紫外灯下观察，有橙红色荧光带的位置即为DNA 条带，电脑拍照记录电泳图谱。

五、实验结果与数据分析

1.记录观察结果：

阳性对照_____________水样总DNA_____________阴性对照_____________

注：阳性对照有目的条带，水样总DNA 有目的条带，阴性对照无目的条带，说明PCR实验成功。

2.参考电泳图（图7-3）

图7-3　PCR 产物琼脂糖电泳图

注：1—阴性对照；2—阳性对照；3—样品；4—样品；M—DL2000 Marker

六、问题与讨论

1.什么是PCR？PCR 技术的基本原理是什么？该技术在环境领域有何应用？

2.简述PCR 五要素在PCR 过程中的功能及各要素对PCR 结果的影响。

3.设计PCR 引物时，需要注意些什么？

4.如果PCR 产物电泳后发现样品没有出现目的条带，可以从哪些方面来分析出现此种情况的原因？

七、注意事项

1.阴性对照是PCR 结果可靠性的保证，每一次PCR 都必须设置阴性对照，只有在阴性对照无目的条带，而样品出现目的条带时才能证明PCR 实验成功。阴性对照出现目的条带，说明试剂被污染或操作过程中引入了污染，实验结果不可信。

2.设置阳性对照，可以避免假阴性结果。如果出现样品无目的条带，且阳性对照无目的条带，则很可能是PCR 操作出现问题或PCR 试剂失效。阳性对照出现目的条带，样品没有目的条带的情况则很可能是样品DNA 质量不够好（DNA 浓度过低或存在抑制PCR 反应的物质等）或样品中目的基因浓度低于PCR 检测限。

3.不同公司生产的Taq DNA 聚合酶的酶浓度不同，根据说明书的推荐用量加入合适体积的酶，大多DNA 聚合酶的最适温度是72℃，也有一些较为特殊的，要根据说明书设置延伸温度。

4.由于PCR 实验中加入试剂量都比较少，为了避免试剂未加入反应体系的操作失误，按体积从多到少的顺序加入试剂，且每次都需将Tip头插入液面以下。

5.EB 是致癌剂，使用中要注意防护并控制污染范围。有条件的实验室建议用Gel Red、SYBR Green、Gold View、Gel Green等毒性较小的染料替代EB，使用时注意选用合适的激发光波长。