DNA提取：多环境介质实验

一、实验目的

了解总脱氧核糖核酸（DNA）提取的基本原理；学习并掌握样品总DNA 提取的基本操作方法；了解各类环境样品DNA 提取的基本思路。

二、实验原理

从样品中分离纯化基因组脱氧核糖核酸（DNA）的技术称DNA 提取。环境样品总DNA 的提取是微生物分子生态学研究中最重要的实验技术之一，提取DNA 的质量将直接影响后续分析结果的可信度。

DNA 存在于细胞内，在细胞中以脱氧核糖核蛋白复合物（DNP）形式存在。从细胞中提取DNA 时，先把DNP与细胞碎片等其他杂质分开，再进一步将DNA 与核蛋白分离，得到纯化的DNA。DNA 呈弱酸性，溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂，其钠盐比游离酸DNA 易溶于水。提取DNA 时常采用1mol／L 的氯化钠浓度以增加DNA 在水中的溶解度。DNA 在酸性溶液中易水解，一般保存于pH=8.0的弱碱性溶液中。

DNA 的提取主要包括以下三个方面。

1.细胞的裂解

细胞裂解指用物理、化学或酶促方法使细胞裂解释放出DNA 的过程。环境样品常用的细胞裂解方法有物理裂解法（机械裂解法）、化学裂解法和酶裂解法。常用物理方法有：煮沸、冻融、微波、超声、研磨或玻璃珠振荡等；化学法包括浓盐、表面活性剂、热酚等，酶解法包括溶菌酶、蜗牛酶、蛋白酶等。DNA 提取中可选用上述一种或多种细胞裂解法，以提高细胞裂解效率，并保持DNA 分子的完整性。

2.蛋白质的去除和DNA 沉淀

酚-氯仿抽提法是传统的蛋白质去除方法，其作为蛋白质变性剂，同时抑制脱氧核糖核酸酶（DNase）的降解作用。抽提过程中，变性蛋白质的密度比水大比酚-氯仿小，因而离心后会沉淀在水相与酚-氯仿相中间。小心取出水相，多次重复抽提，可以彻底去除蛋白质。利用DNA 不溶于乙醇的特点，水相中加入终浓度为75%的乙醇，低温沉淀DNA，离心即可分离DNA。异丙醇也常被用于沉淀DNA。

3.DNA 纯化及DNA 提取效果的检测

沉淀得到的DNA 常含有腐殖酸、酚、氯仿等杂质，会影响后续分子生物学操作，需要进行纯化。纯化方法主要有电泳回收、氯化铯密度梯度离心、纯化试剂盒纯化等。氯化铯密度梯度离心有很好的分辨率，双链DNA，单链DNA，RNA 及蛋白质具有不同的密度，离心时形成不同密度的区带，该方法需要超速离心，适合大量DNA 的制备。电泳回收是DNA琼脂糖电泳后，切割下含有DNA 的胶块，用胶回收试剂盒回收凝胶中的DNA，该方法得到的DNA 纯度高，是分子生物学操作中常用的DNA 纯化方法。纯化试剂盒纯化指利用纯化试剂盒直接对DNA 进行纯化的方法，目前常用的DNA 纯化试剂盒大多采用纯化柱离心法，即在一定的条件下，核酸被选择性吸附到核酸吸附材料上，从而与其他杂质分离。受限于核酸吸附材料的核酸吸附量，该方法适用于少量DNA 纯化。

提取DNA 的量和纯度是衡量DNA 提取质量的重要参考指标，常用琼脂糖电泳检测DNA 完整度，用OD260（核酸吸光度）、OD280（蛋白质或氨基酸的吸光度）和OD230（其他杂质，如酚、盐类、多糖等的吸光度）的值来判定DNA 的浓度及纯度。标准DNA 样品浓度为1μg／mL时，其OD260=0.02，所以当OD260=1时，dsDNA 浓度约为50μg／mL，ssDNA 浓度约为37μg／mL。OD260／OD280反应核酸中蛋白质、RNA 的情况，纯DNA 的OD260／OD280≈1.8，该比值若大于1.9，说明DNA 中很可能有RNA 污染；若小于1.6则说明DNA 中有蛋白质、酚等污染。OD260／OD230 表征DNA 受多糖、酚、盐类等污染的程度，纯净的核酸OD260／OD230应该为2～2.5，过大或过小都说明核酸中有其他杂质污染。

环境样品种类较多，如饮用水、河流湖泊水、污水、土壤、沉积物、活性污泥、厌氧污泥等，对于气体样品、较为洁净的水样（如饮用水、海水）DNA 提取可以先用0.22μm 滤膜过滤，将微生物截留到膜上，再将膜剪碎放入离心管中裂解细胞提取DNA。污水、污泥样品可以先离心，去上清液后按土壤、沉积物类似的方法裂解细胞提取DNA。河流湖泊水根据水质情况选择过滤或离心处理后提取DNA。试剂公司推出了针对各类样品的商品化DNA提取试剂盒，其中一些能很好地提取小量DNA，如Mo Bio公司和MP Bio公司，这两个公司的试剂盒种类全，且提取的DNA 质量较好，一般无须再纯化，即能满足后续分析实验的纯度需要，但价格昂贵。下面以传统的DNA 提取法为例说明水样及土壤样品的DNA提取。

三、实验条件

1.仪器设备

样品处理器（MP FastPrep），水浴锅，单道可调微量移液器，台式高速离心机。

2.试剂与样品

无菌0.22μm 微孔滤膜，TE 溶液（10 mmol／L Tris-HCL，1 mmol／L EDTA，pH=8.0），DNA 提取缓冲液（100mmol／L Tris-HCl，100mmol／L EDTA，100mmol／L Na3PO4，1.5mol／L NaCl，1%CTAB，pH=8.0），20mg／mL 溶菌酶，10mg／mL 蛋白酶K，10 mg／mL RNase A，20% SDS，酚∶氯仿∶异戊醇（25∶24∶1），氯仿∶异戊醇（24∶1），5mol／L NaCl，3mol／L NaAc（pH=5.2），无水乙醇，70%乙醇，异丙醇，无菌Tip头，1.5mL、2mL和50mL离心管。

四、实验步骤

1.水样总DNA 提取

（1）用0.22μm 微孔滤膜过滤水样，根据水样的微生物含量确定需要过滤水的体积，确保滤膜上截留有足够数量的微生物，若微生物细胞数少于103将难以提取DNA。

（2）将滤膜对折（有微生物的面朝内），剪碎，放入2mL 离心管，加1mL TE 充分振荡混匀，去除滤膜，13 000r／min离心1min，去上清液。

（3）沉淀再悬浮于500μL的TE中，加20μL 20mg／mL 溶菌酶，室温放置10min；加40μL蛋白酶K，37℃放置1h。

（4）加1／3体积5mol／L NaCl，剧烈振荡混匀，13 000r／min离心5min，转移上清液至1.5mL离心管中。

（5）加等体积酚∶氯仿∶异戊醇（25∶24∶1），剧烈振荡，13 000r／min离心10min，溶液分为三层，中间白色层为变性蛋白质，小心转移上清液至1.5mL离心管中。重复此步操作，抽提至无可见白色蛋白质层为止。

（6）加等体积氯仿∶异戊醇（24∶1），剧烈振荡，13 000r／min离心10min，上清液转移至1.5mL离心管中。

（7）上清液加入0.6倍体积异丙醇，冰上静置30min，13 000r／min 离心10min，去除上清液。

（8）加500μL 70%乙醇洗涤沉淀，小心去除洗涤液。

（9）加300μL TE重新溶解沉淀，再加5μL 10mg／mL RNaseA 于65℃放置10min，加1／10体积3mol／L pH=5.2 的NaAc，2.5 倍体积无水乙醇，-20℃放置30 min 沉淀DNA，13 000r／min离心10min，去除上清液。(https://www.xing528.com)

（10）加500μL 70%乙醇洗涤沉淀，去除洗涤液。

（11）沉淀于50℃烘干，加50μL TE 溶解。测定，确定DNA 的纯度和浓度，DNA 于-20℃保存备用。

2.土壤样品总DNA 提取

（1）于50mL离心管中加入5g土壤和20mL 无菌水，混匀，8 000r／min离心5min，去除上清液。再加入20mL无菌水重复上述操作。

（2）加入13.5 mL DNA 提取缓冲液（100 mmol／L Tris-HCl，100 mmol／L EDTA，100mmol／L Na3PO4，1.5mol／L NaCl，1% CTAB，pH=8.0），3g无菌玻璃珠，置于Fast Prep样品处理器上，设置运行参数：速度4.0，运行4×30s，运行仪器，破碎细胞。

（3）加入100μL 10mg／mL蛋白酶K 和200μL 20mg／mL溶菌酶，37℃水浴30min，每隔10min颠倒混匀（或用37℃恒温摇床，225r／min振荡30min）。

（4）加入1.5mL 20%SDS溶液，65℃水浴2h，每隔20min轻柔颠倒混匀。

（5）8 000r／min离心15min，小心转移上清液至无菌离心管中。

（6）上清液加等体积氯仿∶异戊醇（24∶1）抽提；重复2～3次，直至无变性蛋白析出为止。

（7）上清液中加入0.6倍体积的异丙醇，-20℃放置30min，沉淀DNA。

（8）12 000r／min 4℃离心20min收集DNA 沉淀。

（9）预冷的70%乙醇漂洗沉淀两次，干燥后用100μL双蒸水（ddH2O）溶解，加入10μL 10mg／mL RNase A，65℃放置30 min，转入1.5 mL 离心管，即为DNA 粗提液。测定OD260／OD280及OD260／OD230，确定DNA 的纯度和浓度，粗提的DNA 于-20℃保存备用。根据需要可用氯化铯密度梯度离心或胶回收试剂盒进行纯化。

五、实验结果与数据分析

提取出来的DNA 除做吸光度测定，一般还要进行琼脂糖电泳，观察DNA 的完整程度。较为完整的DNA 在琼脂糖胶上会形成一条明亮的条带，如图7-1所示。该图为实验室研究生提取活性污泥总DNA 的电泳图，该DNA 完整度较好，适于进行后续分析。

图7-1　基因组DNA琼脂糖电泳图

注：M：①DL2000marker；②1～7：总DNA

六、问题讨论

1.影响DNA 提取效率的因素有哪些？

2.如何根据OD 值来判断DNA 的纯度及浓度？

七、注意事项

1.最好使用新鲜样品，低温保存的样品置冰上解冻且不要反复冻融。

2.样品务必裂解完全、彻底，这是影响DNA 提取率的关键因素。固体样品提取时，如果没有FastPrep样品处理器，可采用涡旋振荡器代替，振荡时间可延长至10min。

3.加入氯仿后要充分混匀，但是动作要轻柔，避免DNA 断裂。离心分离的离心力和时间要足够。

4.转移上清液时，确保不要吸入中间的蛋白层及有机相。如果所得DNA OD260／OD280比值偏低，可以用氯仿∶异戊醇（24∶1）重新抽提一次，再沉淀，溶解。

5.DNA 沉淀离心后，去上清液、去除洗涤液等操作务必小心，不要将DNA 也一并丢弃。不建议直接倒去上清液，特别是洗涤后的DNA 可能与管壁黏合不牢，容易被溶液带走。比较可靠的做法是用移液器小心地将液体吸出，吸液体时Tip头不要碰到DNA 沉淀。

6.DNA 干燥要适度，过分干燥的DNA 很难完全溶解。

7.DNA 溶解可以用无菌水或TE缓冲液，但如果要长期保存，建议用TE 缓冲液。TE缓冲液中的EDTA 可以螯合Mg2+和Mn2+，从而抑制DNase，并且TE缓冲液pH=8.0，可以防止DNA 酸降解，利于DNA 长期稳定保存。