环境现代仪器分析实验：微生物分析方法

现行微生物分析标准中的主要方法是传统培养法。传统培养方法能够真实反映样品中存活的微生物，对实验室仪器要求较低。同时，传统方法往往也存在培养周期长，特异性差、敏感度低、无法检测非可培养态（Viable but Non-culturable，VBNC）细菌等缺点。相较而言，分子生物学方法比较快捷，具有高特异性和低检测限的优点。下文介绍近年来在微生物定性定量分析和群落结构分析中运用较为广泛的几种分子生物学分析方法。

7.1.2.1　微生物定性定量分析

可用于微生物定性定量分析的方法主要包括聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR），荧光定量PCR（Real-time Quantitative PCR，qPCR），数字PCR（digit PCR，dPCR），荧光原位杂交（Fluorescence in Situ Hybridization，FISH）和DNA 微阵列芯片（DNA Microarray）等。

1.聚合酶链式反应（PCR）

常规的PCR 主要是基于温度变化时DNA 链“变性—复性—延伸”的原理，通过设计特异性的引物，对目标微生物的特征基因片段进行扩增，从而判定样品中是否含有该类微生物并初步估计其浓度水平。PCR 反应体系必备五要素为引物、DNA 聚合酶、dNTP、模板和Mg2+，PCR 扩增的终产物可以根据后续电泳条带的位置和亮度进行定性和半定量分析。PCR 技术灵敏度高、特异性好，并且操作简便，在环境微生物领域具有广泛应用。PCR 可以和多种其他技术联用，实现不同的分析目的。例如，PCR 可以和克隆、测序联用，针对细菌菌落进行种属鉴定，通过对PCR 产物进行酶切后电泳分析，通过图谱比对分析目的核酸序列的基因型。

2.荧光定量PCR（qPCR）

荧光定量PCR 技术在PCR 体系中加入了荧光探针或染料，从而可以利用荧光信号变化实时监测PCR 扩增过程中每一轮循环扩增产物量的变化，通过荧光信号达到指定阈值时候对应的扩增循环数值（Cycle Threshold，Ct）和标准曲线对起始模板进行相对和绝对定量。同PCR 一样，qPCR 主要包含了“变性—复性—延伸”三个温度变化步骤，qPCR 的总循环数一般为40。在扩增过程中，荧光信号的增加和PCR 扩增产物的数量成正比。在某一特定的样品中，若目的核酸片段的数量较多，在扩增循环早期（低Ct值）即能观察到荧光信号的跃增。若目的核酸片段的数量稀少，可能在扩增循环的晚期（高Ct值）能观察到荧光信号的跃增。Ct值可用于计算核酸的起始拷贝数。与PCR 相比，qPCR 具有以下四个优点：①可以实时监控PCR 的反应过程；②可以在每个扩增循环结束时精确地测定产物的数量；③浓度测定范围广，可跨越若干数量级；④扩增和检测同步进行，不需要后续额外实验分析。且qPCR 比常规PCR 技术灵敏度更高，特异性更强，在定量分析领域具有广阔的发展前景。

3.数字PCR（dPCR）

由于qPCR 依赖一定浓度梯度的标准品进行定量，其受到标准品质量以及待测样品浓度范围等各种限制。数字PCR 则是一种不依赖标准品即可进行定量，而且可以实现较qPCR 更低的检测限的技术。

dPCR 的基本原理是将样品和定量PCR 预混试剂随机分配到大量独立反应单元中（每个反应单元中可能存在1个目的核酸片段或者不存在目的核酸片段），在每个独立反应单元进行PCR 扩增，获得扩增信号的记录为1，未扩增的则记为0。反应结束后，根据记录为1的单元数量得出目的核酸片段的绝对拷贝数。基于此原理，dPCR 测定的不确定性来自测定样本体积的误差和每个分配的独立单元格含有多于1个目的核酸片段的可能性，后者可以根据泊松公式通过概率修正所得目的核酸片段的数量。因此，增加独立单元格分配的数量，可以增大dPCR 方法的灵敏度。有研究表明，dPCR 对水体中存在的有机质等PCR 抑制物有更好的抵抗性能，在eDNA（environmental DNA）检测方面比荧光定量PCR 更有优势。

4.荧光原位杂交（FISH）

FISH 的原理是利用非放射性荧光物质（如生物素、地高辛等）标记的DNA 或RNA 序列作为探针，按照碱基互补原则与待测样品的DNA 或RNA 进行特异性结合，再通过荧光显微镜等观察微生物特定核苷酸序列的存在、数目和定位。FISH 的目标分子通常是具有保守序列的16SrRNA，因其在生物体内拷贝数较多，分布广并且功能稳定，依据其序列设计相应探针，可实现目标微生物原位检测。FISH 技术的主要步骤包括探针制备、样品固定、预处理、原位杂交、洗脱以及荧光信号检测与结果分析。在原位杂交过程中，主要影响因素为温度、杂交缓冲液甲酰胺浓度和洗脱液中NaCl浓度等。FISH 具有快速、可原位及可实现定量分析等优点，然而由于细菌普遍存在的自发荧光现象可能导致假阳性结果，此外一些生长缓慢的细胞，其rRNA 含量较低，也可能导致荧光信号很弱而出现假阴性结果。

5.DNA 微阵列芯片（DNA Microarray）

DNA 微阵列芯片又称基因芯片（Gene Chip），指在表面集成了具有相当密度（阵点间距小于500 μm）核酸探针阵列的微小基片，如硅片、玻璃片或者塑料片等。根据碱基互补原理，将荧光标记的待测样品与芯片上的核酸探针进行杂交，通过杂交信号检测得到基因序列和表达丰度等方面的信息。在基片上进行高密度微阵列制备是微阵列芯片的关键步骤。微阵列芯片具有高通量、自动化、低成本等诸多优点，能够一次分析大量基因并进行大信息量筛选，可大大提高检测效率。但微阵列技术对低丰度样品的灵敏度较低，此外对于相似序列样品，有交叉杂交现象。

7.1.2.2 微生物群落结构分析

用于微生物群落结构分析的方法较多，比较常见的包括传统的变性梯度凝胶电泳（Denaturing Gradient Gel Electrophoresis，DGGE），末端限制性酶切片长度多态性（Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism，T-RFLP），单链构象多态性（Single Strand Conformation Polymorphism，SSCP）等方法。近年来，高通量测序技术（High-thoughput Sequencing）迅猛发展，逐渐成为微生物群落结构分析的主要研究手段。

1.DGGE

DGGE技术是在普通凝胶电泳基础上发展起来的DNA 分离技术，最早由Lerman等于1984年提出。1993年该技术用于微生物群落结构研究。DGGE技术的主要原理是利用碱基序列存在差异的DNA 在含不同浓度变性剂的聚丙烯酰胺凝胶（Polyacrylamide Gel Electrophoresis，PAGE）中解链行为的差异，根据电泳迁移速率的变化，将片段大小完全相同但碱基组成不同的DNA 片段分开。在微生物群落结构及多样性分析研究中，普遍采用的PCR-DGGE是先将提取的样品DNA 进行PCR 扩增后，再进行DGGE分离、割胶、测序。其主要步骤包括样品DNA 提取，样品16SrDNA（或18SrDNA）基因片段PCR 扩增，DGGE电泳以及后续结果分析。在DGGE 电泳步骤中，通过预实验确定最佳变性剂梯度、凝胶浓度、电泳温度和时间等实验条件是决定DGGE结果好坏的关键因素。DGGE 也存在如下缺点：①实验步骤较为繁琐，摸索最适实验条件耗时较长；②只有占群落细菌数量一定比例的类群才能被DGGE 检测；③对DGGE 条带中微生物分类鉴定需要进行条带切割、PCR 扩增和测序等步骤，且往往由于分辨率低，所割取亮带包含两种以上微生物的信息导致测序失败。(www.xing528.com)

2.SSCP

SSCP是一种核酸分离技术，与DGGE类似，可以分离长度相同但序列不同的核酸。其原理是利用非变性条件下，单链DNA 分子由于分子间相互作用，可以形成一定的构象，当单链DNA 的一个碱基发生改变时，其分子的空间构象会发生变化。空间构象不同的单链DNA 分子在非变性聚丙烯酰胺凝胶中因排阻能力不同在PAGE 电泳中彼此分开。SSCP技术的主要步骤包括PCR 扩增DNA，变性，非变性聚丙烯酰胺凝胶制备，电泳，染色及结果分析。SSCP技术实验成本低、操作相对简单、灵敏度较高，但SSCP 对实验温度要求较严格、对大片段核苷酸（＞400bp）检出率较低，无法检出少量空间构象差异不大的片段。

3.T-RFLP

利用T-RFLP技术分析微生物群落时，首先确定目标DNA 片段，根据目标基因上保守区域（16SrDNA 或18SrDNA）设计一对引物，其中一个引物的5′末端用荧光物质标记，然后提取待测样品总DNA，经PCR 扩增后，所得扩增产物的一端就带有了这种荧光标记物。再利用适当的限制性内切酶消化PCR 扩增产物，获得长短不一的限制性片段（T-RFs），通过DNA 测序仪可以检测到末端带有荧光标记物的片段。由于核苷酸序列具有多态性，不同长度的末端限制性片段可代表不同微生物，而相同长度的末端限制性片段则代表至少一种微生物的存在，因此T-RFLP技术可以用来反映微生物菌落组成的情况。T-RFLP技术具有分辨率高、简单快速、易于实现自动化等特点。但T-RFLP实验过程中影响因素众多，样品总DNA 提取、PCR条件优化以及限制性内切酶的选择均对结果产生影响。此外，T-RFLP图谱中每个T-RFs可能不止对应一个菌种，易造成对细菌种群多样性的低估。

4.高通量测序

最早的第一代测序（First Generation Sequencing，FGS）技术首先由Wu等提出，后经Sanger进行了改进，故又称Sanger测序法。第二代测序法则以454焦磷酸测序和Illumina测序应用最为广泛。其中，Illumina因测序成本低，市场份额较高。虽然不同测序平台具体技术原理存在差异，第二代测序法仍存在一些共同点，例如，都包括基因片段化、文库制备、空间上聚集PCR 扩增产物、循环阵列测序等基本步骤。高通量测序可改对上百万余DNA 分子进行序列测定，可获得复杂环境微生物群落结构的丰富信息。目前高通量测序技术已经发展到了第三代。第三代测序技术（Third Generation Sequencing，TGS）最大特点是单分子测序技术（Single Molecule Sequencing，SMS），测序无须经过PCR 扩增过程。Harrs等在Science首次报道了他们开发的真正单分子测序技术（Ture Single Molecule Sequencing，TSMS），其原理是在随机打断的待测DNA 样品片段的末端添加poly（A），然后与检测芯片的poly（T）杂交、定位，并逐一加入荧光标记的末端终止子，洗涤、采集荧光信号后，切开荧光染料和抑制基团，再洗涤、加帽，掺入下一个核苷酸，进行下一轮反应，最终获得完整的序列信息。其后，Pacific Biosciences 公司推出了单分子实时技术（Single Molecule Real Time，SMRT），该方法在聚合反应的同时就可以读取测序产物，其测序速度快，并且具有读长较长的优点。此外，Oxford Nanopore Technologies推出了基于纳米孔原理的GridIOn测序仪，ZS Genetic则试图将高分辨的透射电镜引入到DNA 测序研究之中。目前关于高通量测序技术的研究层出不穷，然而如何降低测序成本，并且快速地对海量测序数据信息进行分析是今后的研究重点。

7.1.2.3　活性细胞的表征方法

1.反转录PCR（RT-PCR）

死亡细胞的RNA，尤其是mRNA，半衰期很短，会迅速降解，因此可以用RNA 来表征具有代谢活性的细胞。反转录PCR（Reverse Transcription PCR，RT-PCR）是以RNA 为基础的分子生物学技术，其原理是将提取样品的RNA 反转录成cDNA，再以cDNA 为模板进行PCR 扩增检测。反转录技术也可以和qPCR 联用，用于定量分析基因表达、RNA 病毒含量测定等。

2.活性PCR（Viable PCR）

传统PCR／qPCR 技术无法判断DNA 来自活菌或死菌，因此，为定量环境样品中存活微生物开发具备识别细菌活性状态的分子生物学方法具有重要意义。

叠氮溴化丙锭（Propidium Monoazide，PMA）和叠氮溴化乙锭（Ethidium Monoazide，EMA）是两种能够透过凋亡细胞的细胞膜而不能透过完整未受损的活细胞膜的核酸染料，它们进入细胞后和DNA 不可逆共价结合，使得凋亡细胞的DNA 无法被后续PCR 反应扩增。因此，有技术将PMA 或EMA 和PCR／qPCR 结合，所形成的PMA（EMA）-PCR／qPCR 联合法既可以区别活细菌和死细菌，又可以对细胞膜未破损的仍具有活性的非可培养态部分细菌进行检测。对水体特定病原菌灭活实验发现，三种方法所测得微生物数量排序为：qPCR＞PMA-qPCR＞平板培养法，表明了PMA-qPCR 测定活性细菌的有效性。PMA 和EMA 两种染料通过细胞膜的渗透性能不尽相同。EMA 不仅能进入破损的细胞膜，对活细胞的完整细胞膜也有一定的渗透作用，而PMA 则会被活细胞完整的细胞膜有效排除，其细胞毒性效应也较低。当使用细胞膜完整性作为判断凋亡活细胞标准时，PMAqPCR 技术往往更具有优势。实际应用中，染料的具体选择还需综合考虑样品类型，样品中死细胞数量，染料浓度，光源以及温育时间等诸多因素。

3.流式细胞仪（FCM）

流式细胞仪（Flow Cytometry，FCM）耦合细胞染色也常用于鉴别凋亡／活细菌。FCM是一种可以对单个细胞或其他生物粒子进行快速计数的方法，能同时实现对细胞大小、形状、荧光信号等多参数的同时测定。将细胞染色法和FCM 相结合，可同时测定样品中细菌的总数及细胞的数目。采用碘化丙啶（PI）和噻唑橙（TO）对样品进行染色，PI（或其他类似染料）无法穿透完整的细胞膜，只能对细胞膜破损的凋亡细胞进行染色，而TO（或其他类似染料）可以对所有细胞进行染色。使用染色法和FCM 联用，可以根据两种染料染色的不同结果对样品中凋亡细菌与活细菌进行区分。

7.1.2.4　基于蛋白质的生物学分析方法

基于DNA／RNA 的分子生物学方法在基因层面提供了微生物种类和丰度、群落结构、功能等信息，但是，这些基因是否在某一特定环境中被表达却无从考量。基因表达存在时空差异性，而且微生物之间或与特定环境的相互作用也可能引起基因的选择性表达，因此以蛋白质为研究对象的生物学分析方法能更直接反映环境系统中微生物功能及其动态变化。

环境样品中总蛋白质的生物学分析步骤包含样品中总蛋白质的提取、蛋白质的分离及蛋白质的鉴定和分析。根据蛋白质分离方法的不同，可以分成凝胶电泳法（gel-based）和液相色谱法（liquid chromatography-based）。凝胶电泳法将完整的蛋白质进行分离，可以生成微生物群落的蛋白质表达谱并进行不同样品间的比较。凝胶法分离后的蛋白质可进一步酶解，并进行质谱分析，鉴定蛋白质的种类。与凝胶法不同，色谱法首先将蛋白质酶解为短肽，再通过液相色谱进行分离，并进一步用质谱进行物质鉴定，后者又被称为“鸟枪法”。