水中溶解性有机污染物三维荧光光谱法分析

一、实验目的

掌握荧光光谱的基本原理；了解荧光光谱仪的组成结构和使用方法；掌握三维荧光光谱分析法的基本原理及应用于表征水体中溶解性有机物的方法。

二、实验原理

1.荧光的产生

当物质分子吸收了特征频率的光子，由原来的基态能级跃迁至电子激发态的各个不同振动能级。激发态分子通过各种形式消耗了部分能量，迅速下降至第一电子激发态的最低振动能级，并停留约10-9s之后，直接以光的形式释放出多余的能量，下降至电子基态的各个不同振动能级，此时所发射的光即是荧光。但若电子以隙间穿越的方式转至激发三重态，由激发三重态的最低振动能级回到基态，即发出磷光。由于发出磷光的过程是跃迁禁阻的，因此时间较长，磷光的寿命也较荧光更长，而相对荧光，磷光的能量更低。

光谱包括激发光谱和发射光谱。激发光谱表示的是不同激发波长下所引起物质发射某一波长荧光的相对效率。在固定发射波长下（通常是选取最大发射波长），以不同波长的入射光激发荧光物质，以荧光强度对激发波长作图，即得到激发光谱。而在激发光谱曲线的最高处表明处于激发态的分子最多，荧光强度最大，此处称为最大激发波长。当把激发波长固定在最大激发波长处，进行发射光谱扫描，测定出不同波长下相应的荧光强度，以荧光强度与发射波长作图，即得到发射光谱。激发光谱与发射光谱之间的波长差值为定值，称为Stokes位移。荧光光谱总是呈现出发射波长位于激发波长的长波一侧，这是由于在电子跃迁的过程中，振动弛豫、内转换等非辐射跃迁损失了部分能量。

2.影响荧光强度的因素：

（1）荧光强度与溶液浓度的关系。在稀溶液中，荧光强度与溶液浓度成正比关系；而在较浓的溶液中由于猝灭和自吸收现象，使得浓度与荧光强度无线性关系。

（2）溶剂对荧光强度的影响。溶剂的极性增大，π→π＊跃迁所需的能量差减小，跃迁概率增加，从而使荧光光谱红移，发射强度增强。而溶剂的黏度的减小，会增加分子间的碰撞机会，使无辐射跃迁增加，从而使得荧光强度减弱。因此，荧光强度随溶液黏度的减小而减弱。

（3）温度对荧光强度的影响。温度升高，分子的运动速度加快，使得分子间碰撞的概率增大，外转换去活概率增大，荧光强度下降。

（4）其他因素。溶液中含有能够吸收激发光或荧光物质发射光的物质，即产生内滤光效应。

（5）荧光光谱中的散射光。有一小部分光子在与物质分子接触时发生了碰撞，光子的运动方向发生了改变或发生了能量的交换。常见的散射峰有瑞利散射和拉曼散射。

3.荧光光谱仪的组成及作用：

（1）光源，提供紫外至红外波长范围内的激发光。常用的光源有氙灯、超连续激光光源、脉冲光源。

（2）激发单色仪，用于扫描激发光谱。其中利用光栅对混合光进行分光，通过狭缝调节光的带宽。

（3）样品仓，根据不同的样品和测试种类可配置不同的样品测试附件，如自动滴定分析仪、固体样品支架、控温装置、磁力搅拌装置等。

（4）发射单色仪，用于扫描发射光谱。

（5）检测器，用于信号的采集，包括参比检测器和荧光检测器。

（6）主控系统，控制全部光学部件，记录检测器获得的信号，得到荧光光谱图，并可对谱图进行分析处理等。

三维荧光法是将荧光强度表示为激发波长—发射波长两个变量的函数，即三维荧光光谱（Three-Dimensional Excitation Emission Matrix Fluorescence Spectrum ，3DEEM），它能够表示激发波长（λex）和发射波长（λem）同时变化时的荧光强度信息。

表6-1　水体中常见的溶解性有机物的荧光峰位置

三、实验条件

1.仪器设备(www.xing528.com)

HORIBA FLuoroMax4荧光光谱仪。

2.试剂与样品

超纯水，天然水体样品。

3.测试参数

激发波长范围：240～450nm；扫描间隔：5nm；狭缝：5nm。

发射波长范围：290～550nm；扫描间隔：5nm；狭缝：5nm。

四、实验步骤

1.打开仪器主机，稳定30 min。插入软件“PassDog”（密码狗）后打开软件“Fluor Essence”（荧光软件），点开“Experiment Menu button”（仪器主菜单）。

2.扫描仪器的灯谱：在弹出的“Fluorescence Main Experiment Menu”（荧光光谱仪控制主菜单）菜单框中选择“Spectra”（光谱），选择扫描激发光谱（Excitation）。设置参数，Ex激发范围240～600nm，狭缝（Silits）为1.0nm，间隔Inc为0.5nm。检测器选择R1，确认灯的能量。

3.石英样品比色皿中加入超纯水，扫描水的拉曼峰：在弹出的“Fluorescence Main Experiment Menu”（荧光光谱仪控制主菜单）菜单框中选择“Spectra”（光谱），选择扫描发射光谱（Emission）。设置参数，Ex激发波长为350nm，狭缝宽度为5.0nm，Em 发射范围为365～450nm，狭缝宽度为5.0nm，间隔Inc为1nm，检测器选择S1。根据水的拉曼峰最强位置397nm 的强度与450nm 处基线的信号，可以计算仪器的信噪比。

4.在石英比色皿中加入样品至比色皿2／3 处，扫描不同天然水体的三维荧光谱图：在弹出的“Fluorescence Main Experiment Menu”（荧光光谱仪控制主菜单）菜单框中选择“3D”。设置参数，激发波长范围：240～450nm；扫描间隔：5nm；狭缝：5nm；发射波长范围：290～550nm，扫描间隔：5nm；狭缝：5nm，检测器信号选择S1c／R1c。

5.所有测试结束后，关闭软件，关闭仪器。

五、数据处理与谱图解析

根据得到的样品的三维荧光谱图（图6-4）确定不同峰位置的有机物的种类，并根据峰的强弱，确定有机物含量的高低。

图6-4　某水样的三维荧光光谱图

六、问题与讨论

1.列举影响物质荧光强度的因素有哪些？

2.列举三维荧光技术在不同领域的三个应用实例。

七、注意事项

1.在准备样品时，对于有颜色的样品要注意其色度，颜色会对荧光光谱产生影响。

2.扫描灯谱观测灯的能量，随着使用时间的增加，氙灯的能量会有所下降，当能量过低时应该更换氙灯，避免有些含量较低的荧光物质无法检测出。