磺酰脲类除草剂残留分析：液相色谱-质谱联用仪效果

一、实验目的

掌握液相色谱串联质谱（LC-MS-MS）的基本原理；了解液相色谱-质谱仪的基本结构；进一步巩固固相萃取前处理方法及注意事项；掌握液相色谱-质谱法定量分析的基本过程。

二、实验原理与仪器结构

土壤中磺酰脲类除草剂目标物首先通过碱性磷酸缓冲液进行提取，然后将提取液经C18固相萃取柱进行净化，提取液经进一步浓缩后调节pH 值到酸性使目标组分以分子形式存在，目标物经液相色谱柱分离，三重四极杆质谱检测，外标法定量。

高效液相色谱是一种准确度高，分离范围广的快速分离方法，适合有机分子和生物分子的分离。质谱具有其他分析方法无可比拟的灵敏度，对于未知化合物的结构分析定性十分准确。液相色谱-质谱联用技术以液相色谱作为分离系统，质谱作为检测系统，经纯化后的样品在液相色谱和质谱部分经过分离和离子化，经由检测器得到质谱图。液质联用体现了色谱和质谱优势的互补，结合了色谱对复杂样品的高分离能力和质谱的高选择性、高灵敏度及能够提供相对分子量和结构信息的优点，在农残领域有广泛的应用。特别是三重四极杆串联质谱，在定量分析方面具有绝对的优势（见实验5.5）。

典型的液相色谱三重四极杆质谱仪结构如图5-16 所示：对比气相色谱-三重四极杆质谱仪与液相色谱三重四极杆质谱仪，二者主要不同在于离子源系统。液相色谱三重四极杆质谱的常用离子源有电喷雾电离源（ESI）和大气压化学电离源（APCI），最常用的是ESI。ESI是比APCI应用范围广的电离方式。ESI和APCI通常产生（M+H）+ 或（M-H）- 等准分子离子，源参数易调，操作简单，仪器灵敏度高。对APCI源来说，不足就是给出的结构信息有限，样品易发生热裂解，低质量时基线噪声大。ESI通常只产生分子离子峰，可以直接测定混合物，并可以测定热不稳定的极性化合物，其易形成多电荷离子的特性可分析蛋白质和DNA 等生物大分子。通过调节离子源电压控制离子的碎裂（源内CID）得到化合物的部分结构。质量分析器部分同气相色谱-三重四极杆质谱仪。

图5-16　液相色谱三重四极杆质谱仪结构图

三、实验条件

1.仪器设备

液相色谱三重四极杆质谱仪Accela-TSQ Quantum Access（Thermo Fisher），分析天平（感量0.1mg），超声波振荡器，离心机，氮吹仪，涡旋混合器。固相萃取装置：可调节流速，流速范围1～20mL／min。

一般实验室常用仪器和设备。

2.试剂与样品

农田土壤样品若干，纯水（Millipore），乙腈（农残级），甲醇（农残级），磷酸二氢钾（分析纯），磷酸氢二钾（分析纯），磷酸（分析纯），冰乙酸（分析纯），氢氧化钠（分析纯），农药标准溶液（纯度≥96%），固相萃取小柱（填料为C18 或等效类型填料或组合型填料，500mg／6mL），氮气（纯度≥99.999%）。

3.测试参数

以液相色谱三重四极杆质谱分析农田土壤中磺酰脲类除草剂残留为例（不同仪器型号、不同性质样品应重新确定实验条件，见表5-11和表5-12），配置自动进样器。

色谱柱：C18柱，4.6mm×250mm，5μm；

柱温箱：30℃；

进样量：10μL；

数据采集方式：选择反应监测（SRM）。

表5-11　流动相组成

表5-12　选择离子参数设定表

四、实验步骤

1.试剂准备

用移液器将农药标准溶液逐级稀释，准确配置0.1 mg／L，0.2 mg／L，0.5 mg／L，1.0mg／L，2.0mg／L，5.0mg／L，10.0mg／L的磺酰脲类除草剂系列标准溶液。(www.xing528.com)

2.样品准备

（1）样品制备：农田土壤样品过1mm 筛后，置于-18℃冷冻箱保存，备用。

（2）磷酸缓冲溶液配制：0.038mol／L的磷酸二氢钾和0.16mol／L 的磷酸氢二钾，用磷酸及氢氧化钠调节pH=7.8。

（3）目标物提取：准确称取10g 土壤样品于50 mL 聚苯乙烯具塞离心管中，加入10.0mL提取液（乙腈+磷酸缓冲溶液，2∶8），在涡旋混合器中剧烈旋涡1min，然后超声提取5min，4 000r／min离心5min。提取步骤重复3次，每次提取液均为10mL，合并3次提取并离心后的上清液于50mL烧杯中，加入约1mL磷酸调节pH 至2.5±0.1，待净化。

（4）固相萃取小柱净化

● 活化：每一个固相萃取柱依次用5mL乙腈、5mL 磷酸缓冲溶液（pH=2.5±0.1）活化，活化时，不要让液体流干（液面不低于吸附剂顶部）。

● 上样：前述待净化的所有提取液过柱，流速控制15mL／min左右，整个过程中小柱上液面始终高于吸附剂。

● 干燥：抽真空干燥小柱10～15min。

● 洗脱：3mL乙腈+磷酸缓冲溶液（9∶1）洗脱，收集于小试管中，氮气吹至近干，乙腈定容至1.0mL。

（5）样品加标：分别取0.1mL，0.5ml，1.0mL浓度为10mg／L 的混合标准溶液至平行的10g土壤样品中，按照上述样品前处理步骤进行样品加标，各浓度水平平行制备3份。

3.上机分析

（1）仪器参数调整及优化：采用正离子模式，扫描范围100～500amu，喷雾电压4 000V，鞘气压力20psi，辅助气压力5psi，温度350℃，碰撞气为高纯氩气。在此基础上通过注射泵将1mg／L农药标准品混合溶液导入电喷雾电离源，对上述参数进一步进行优化，以获取最佳的检测条件，建立质谱方法。

（2）打开Xcalibur软件，点击“method”（方法）按钮，按照色谱及优化后的质谱条件分别进行参数设定，并根据自动进样器型号设定进样体积、洗针方法等参数，保存方法。

（3）点击“sequence”（序列）按钮，设置标准样品及未知样品类型、进样次数、测定方法及稀释倍数等参数，保存序列文件1。

（4）点击“start”（开始）按钮，开始执行分析。

五、实验结果与数据处理

1.数据采集完毕后，点击“process”（处理）按钮，调用任一标准样品数据（建议选择较低浓度标准样品数据）依次执行色谱峰积分、色谱峰识别、标准样品浓度等参数设置，保存数据处理方法。

2.打开之前序列文件1，点击“process”（处理）按钮，调用保存的“process”（处理）文件，另存序列文件2，执行处理。

3.点击“Quantity（定量）”按钮，打开序列文件2，即可获得处理后的结果，包括标准曲线等相关信息。

4.根据加标样品的分析结果等信息，计算固相萃取前处理的加标回收率。加标回收率计算公式如下：

六、问题与讨论

1.简述液相色谱三重四极杆质谱仪的工作原理及其基本结构。

2.简述电喷雾电离源的原理及结构。

七、注意事项

1.进行质谱参数优化时，当使用1mg／L标准品的响应信号不足时，可以适当提高标准品的浓度，如2mg／L，但不可超过5mg／L。

2.流动相的选择除考虑色谱分离效果外，必须考虑组分进入质谱前离子化效率，以便获得最佳的分辨率和最高的灵敏度，因此应该优化流动相的组成但不可简化。