一、实验目的
掌握索氏提取前处理方法原理和基本处理步骤；掌握高效液相色谱分析法中检测器梯度的设置；了解荧光检测器的基本原理及其适用范围；巩固高效液相色谱仪硬件及软件的相关操作；巩固参数设定，数据采集及数据分析的基本要求。
二、实验原理与仪器结构
1.索氏提取
索氏提取（Soxhlet extraction）也是萃取方法的一种，主要是利用溶剂的回流和虹吸原理，对固体混合物中的目标成分进行连续提取。当提取筒中回流下的溶剂的液面超过索氏提取器的虹吸管时，提取筒中的溶剂流回圆底烧瓶内，即发生虹吸。随温度升高，再次回流开始，每次虹吸前，固体物质都能被纯的热溶剂所萃取，溶剂反复利用，缩短了提取时间，所以萃取效率较高。
2.紫外-可见光检测及荧光检测原理
紫外-可见光（VWD）检测原理（略，见实验5.8）。
荧光检测（FLD）原理：许多有机化合物，特别是芳香族化合物、生化物质，被一定强度和波长的紫外光照射后，发射出比激发光波长更长的光，称为荧光。荧光涉及光的吸收和发射两个过程，被化合物吸收的光称为激发光，产生的荧光称为发射光。荧光的性质与分子结构有密切关系，不同结构的分子被激发后，并不是都能发射荧光，但可以与发生荧光的物质反应衍生化后检测。荧光的波长总要长于分子吸收的紫外光波长，通常在可见光范围内。
荧光强度与荧光物质溶液浓度，摩尔吸光系数，吸收池厚度，入射光强度，荧光的量子效率及荧光的收集效率等成正相关，在其他因素保持不变的条件下，物质的荧光强度与该物质溶液浓度成正比，这是荧光检测器的定量基础。当考虑灵敏度时，测定应选择最大激发波长。
荧光检测法最吸引人的特点是它固有的灵敏度和选择性，它的最小检测限往往要比紫外检测法低一个数量级以上。
3.环境中的多环芳烃
多环芳烃（Polycyclic Aromatic Hydro-carbons，PAHs）有机污染物是指两个或两个以上苯环以稠环形式相连的一类化合物。其脂溶性高，不易降解，易在生物体内积累，具有致癌、致畸和致突变的作用，对人类健康和生态环境具有巨大的潜在危害，是全球关注的一类环境污染物。目前，针对环境及食品中的PAHs主流检测方法为HPLC或超高压液相色谱法（UPLC）和GC-MS。在环境监测中，多个国家将HPLC 和GC-MS 列为标准方法。
三、实验条件
1.仪器设备
全自动索氏提取仪（丹麦Foss公司），附带整套工具。
高效液相色谱仪（Agilent HPLC 1200，配稳压电源、四元泵、自动进样器、柱温箱），带荧光检测器和紫外检测器，Agilent Chemstation色谱工作站；PAHs专用色谱柱：Agilent，Zorbax Eclipse，PAH Columns（4.6×100mm×3.5μm）。
旋转蒸发仪，Millipore纯水机，氮吹仪，天平。
2.试剂与样品
16个PAHs化合物标准样品：萘（NaP），苊烯（AcPy），苊（Ace），芴（Flu），菲（PhA），蒽（AnT），荧蒽（FluA），芘（Pyr），苯并［a］蒽（BaA），（Chy），苯并［b］荧蒽（BbF），苯并［k］荧蒽（BkF），苯并［a］芘（BaP），二苯并［a，h］蒽（DbA），苯并［g，h，i］芘（BghiP），茚并［1，2，3-cd］芘（InP）。
甲醇、乙腈、丙酮、环己烷、二氯甲烷、正己烷、正戊烷等为色谱级或农残级试剂；无水硫酸钠，60～200目超纯硅胶，硅藻土，活性铜粉，超纯水。
3.测试参数
进样：进样量为20μL，洗针进样，洗针液为纯乙腈；
泵：流速为1mL／min；流动相为乙腈和水，其梯度洗脱程序见表5-8；运行时间22min，后运行3min；
柱温：25℃；
紫外检测器：检测波长优化后梯度进行，见表5-9；
荧光检测器：检测波长优化后梯度进行，见表5-10。
表5-7 PAH 分析流动相梯度设置
表5-9 PAHs紫外检测波长程序
表5-10 PAHs荧光检测波长程序
四、实验步骤
1.试剂准备
正己烷-丙酮混合液（1∶1）：用色谱纯正己烷和丙酮酯按1∶1的体积比混合备用；
正戊烷-二氯甲烷混合液（3∶2）：用色谱纯正戊烷和二氯甲烷按3∶2的体积比混合备用；
无水硫酸钠：于马弗炉中420℃温度下烘2h，冷却后备用；
超纯水、乙腈：超声赶气泡。(www.xing528.com)
2.样品准备
（1）标准溶液配制
移取适量的混合标准溶液，用甲醇稀释成1μg／mL（以混合标准里浓度最大的标记）混合母液（在4℃下冷藏保存），使用时用甲醇稀释为10～600μg／mL的标准溶液。
（2）样品前处理
准确称取自然风干、研磨过筛（100目）的土壤样品10g，置于具塞玻璃瓶中，加入10g烘好的无水硫酸钠及5g硅藻土，摇匀后转移到索氏提取器的套管中，用80mL配制好的正己烷-丙酮混合液进行自动索氏提取，提取程序：160℃下热浸提60 min，160℃下淋洗60min（EPA 3540C，EPA 3541）。提取液自然冷却后，用20mL环己烷进行溶剂置换，旋转蒸发（65℃）浓缩至1mL左右。参照EPA 3630C 方法，硅胶（配合放置无水硫酸钠和铜粉）柱层析法净化浓缩后的样品。层析柱填充完成后分别用20mL二氯甲烷和正戊烷淋洗，弃去淋洗液，将浓缩后样品提取液加于柱顶部，25mL 正戊烷-二氯甲烷混合液洗脱目标物，收集洗脱液。旋转蒸发浓缩并将洗脱液溶剂置换为甲醇，定容至1mL。样品过0.22μm滤膜，滤液待测。
3.仪器准备
（1）检查流动相，仪器线路，废液瓶等是否准备妥当；
（2）打开电脑，HPLC各组件电源，打开工作软件；
（3）打开工作界面，按操作要求排出所需流动相（乙腈和超纯水）气泡；
（4）配置仪器（配置1100／1200系统模块，选择需要的模块，主要选择需要的检测器），建立平衡柱子的分析方法，保存并运行；
（5）按测试参数设置标准样品分析方法（供参考，可根据仪器及柱型进一步优化）并保存待用。
4.上机分析
（1）待色谱柱平衡后，设置进样程序（sequence），选择标准样品分析方法、设置进样位置、次数等，设置数据保存路径；
（2）运行设置好的标准样品进样程序，开始分析标准系列样品；
（3）得到16个PAHs的色谱图（紫外检测器和荧光色谱图），并对色谱峰进行积分，根据标准样品的浓度和峰面积建立外标曲线，并将其保存到方法中；
（4）按标准样品分析方法，建立未知样品进样程序，分析未知样品，得到样品色谱图；
（5）分析结束后，建立清洗及保存柱子的方法并运行；
（6）所有程序结束后，关泵、关灯，退出程序，关闭主机、电脑及相关附件。
五、实验结果与数据处理
1.实验记录
原始数据记录：记录实验步骤，实验条件，仪器参数，列表记录原始测试结果（标准溶液浓度、信号值以及样品的信号值）。
2.实验结果
（1）参考色谱图（图5-14，图5-15）
（2）PAHs含量计算
利用保留时间定性，外标法定量。注意原始样品经索氏提取后浓度的变化，计算时要考虑称重及最后的浓缩倍数。
六、问题与讨论
1.简述索氏提取技术的进展。
2.分析混合样品时，检测器波长的设置有何要求？
3.HPLC系统压力过高的原因有哪些？
七、注意事项
1.16个PAHs中“苊烯（AcPy）”没有荧光吸收，如果要全部定量，需要辅以紫外检测。
2.在柱层析的装填过程中，注意：①无论是干法装柱还是湿法装柱，都要确保硅胶填料装得紧实以保证层析柱柱效，可以边加边敲打层析柱。②由于溶剂（主要是二氯甲烷）和硅胶之间吸附放热，容易产生气泡，严重时甚至会造成断层，所以要求硅胶一定要填充结实且用稍多溶剂过柱，待柱稳定后再小心上样。
图5-14 PAHs标准样品紫外检测器色谱图
图5-15 PAHs标准样品色谱图——VWD-FLD信号对比
3.在计算样品浓度时，请注意10mg样品经过索氏提取、柱层析净化、旋转蒸发后浓缩至1mL进样，根据外标法计算出浓缩后的样品浓度后，还需要根据浓缩倍数计算出样品实际浓度。
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