高效液相色谱法(VWD)分析水环境中酚类物质

一、实验目的

掌握液液萃取前处理方法原理和基本处理步骤；了解紫外-可见光检测器（VWD）的基本原理及其适用范围；掌握高效液相色谱分析法中梯度洗脱的设置；巩固掌握高效液相色谱仪硬件及软件的相关操作；巩固参数设定，数据采集及数据分析的基本要求。

二、实验原理与仪器结构

1.液液萃取原理

液液萃取是物质在两液相间的分配过程，是应用最多的分离、净化技术。液液萃取的基本原理是Nernst在1891年提出的分配定律，即在一定温度和压力下，溶质在两种互不相溶的溶剂中达到分配平衡时，浓度之比为一常数，这个常数称为分配系数，其定义为溶质在有机相中的总浓度与水相中的总浓度之比。分配系数越大，水相中的有机物被有机溶剂萃取的效率会越高。

2.紫外-可见光检测原理

基于Lambert-Beer定律，即被测组分对紫外光或可见光具有吸收，且吸收强度与组分浓度成正比。很多有机分子都具紫外或可见光吸收基团，有较强的紫外或可见光吸收能力，因此VWD 检测器既有较高的灵敏度，也有很广泛的应用范围。由于VWD 对环境温度、流速、流动相组成等的变化不是很敏感，所以还能用于梯度淋洗。利用VWD 检测时，为了得到高的灵敏度，常选择被测物质能产生最大吸收的波长作为检测波长。

3.环境中的酚类物质

酚类化合物作为重要的化工原料，广泛应用于炼焦、印染、药物及塑料等工业，其废水对环境危害严重。目前常用的测定酚类化合物的方法有：GC，HPLC和GC-MS。

三、实验条件

1.仪器设备

液液萃取装置；玻璃分液漏斗（250mL）；砂芯过滤器；

高效液相色谱仪（Agilent HPLC 1200），带VWD 检测器（或DAD 检测器）；

色谱柱：Agilent XDB-C18反相色谱柱（4.6×250mm，5μm）；

Millipore纯水机，Zorbax Eclipse氮吹仪。

2.试剂与样品

酚类化合物标准样品：苯酚，4-硝基苯酚，2-甲基-2，6-二硝基苯酚，2-氯苯酚，2，4-二硝基苯酚，2，4-二甲基苯酚，2-硝基苯酚，4-氯-三甲苯酚，2，4-二氯苯酚，2，4，6-三氯苯酚，五氯苯酚。

试剂：乙酸乙酯（色谱纯），甲醇（色谱纯），二氯甲烷（色谱纯）；浓硫酸，无水硫酸钠，氯化钠，冰醋酸，超纯水。

3.测试条件

进样：进样量10μL，洗针进样，洗针液为纯甲醇；

泵：流速为1.0mL／min；流动相为甲醇和2%的冰醋酸，其梯度洗脱程序见表5-7；运行时间25.0min，后运行3.0min；

柱温箱：色谱柱为Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18，4.6×250mm，5μm，柱温：30℃；

紫外-可见光检测器：检测波长为280nm。

表5-7　酚类化合物分析流动相梯度设置

四、实验步骤

1.试剂准备

无水硫酸钠和氯化钠，在马弗炉中400℃烘4h。冷却至室温，置于玻璃瓶中，于干燥器中保存备用；

二氯甲烷-乙酸乙酯混合溶液（4∶1）：二氯甲烷和乙酸乙酯按4∶1 的体积比混合备用；

硫酸溶液（1∶1）：量取50mL 浓硫酸，缓慢加入50mL水中，配好备用；

超纯水、甲醇：超声赶气泡。

2.样品准备

（1）标准溶液配制

移取适量的混合标准溶液（原液），用甲醇稀释成10μg／mL（以混合标准里浓度最大的标记）混合储备液（在4℃下冷藏保存）。使用时用甲醇稀释为1～10μg／mL的标准液。(www.xing528.com)

（2）样品前处理——液液萃取

取200mL水样于分液漏斗中，加入配好的硫酸溶液调整pH≤1（地表水和地下水等清洁水样；基体复杂的水样需要净化，详见国标HJ 744-2015）；称取15g氯化钠加入水样中，振摇使其溶解。量取25mL 配好的二氯甲烷-乙酸乙酯混合溶液，振荡萃取10min（注意放气）；静置，有机相和水相分层，通过放有无水硫酸钠的砂芯过滤器，收集有机相，重复萃取3次，合并萃取液。用氮吹仪吹至微干，甲醇定容至1mL，待测。

3.仪器准备

（1）检查流动相，仪器线路，废液瓶等是否准备妥当。

（2）打开电脑，HPLC各组件电源，打开工作软件。

（3）打开工作界面，按操作要求赶所需流动相（甲醇，2%冰醋酸，超纯水）气泡。

（4）配置仪器（配置1100／1200系统模块，选择需要的模块，主要选择需要的检测器），建立平衡柱子的分析方法，保存并运行。

（5）按测试参数设置标准样品分析方法（供参考，可根据仪器及柱型进一步优化）并保存待用。

4.上机分析

（1）待色谱柱平衡后，设置进样程序（sequence），选择标准样品分析方法、设置进样位置、次数等；设置数据保存路径。

（2）运行设置好的标准样品进样程序，开始分析标准系列样品。

（3）得到11个酚类化合物的色谱图，并对色谱峰进行积分，根据标准样品的浓度和峰面积建立外标曲线，并将其保存到方法中。

（4）按标准样品分析方法，建立未知样品进样程序，分析未知样品，得到样品色谱图。

（5）分析结束后，建立清洗及保存柱子的方法并运行。

（6）所有程序结束后，关泵、关灯，退出程序，关闭主机、电脑及相关附件。

五、实验结果与数据处理

1.实验记录

原始数据记录：记录实验步骤，实验条件，仪器参数，列表记录原始测试结果（标准溶液浓度、信号值以及样品的信号值）。

2.实验结果

（1）参考色谱图（图5-13）

图5-13　11个苯酚类化合物在给定的色谱条件下的色谱图（10μg／mL标准样品）

1.苯酚；2.4—硝基苯酚；3.2—甲基-2，6—二硝基苯酚；4.2—氯苯酚；5.2，4—二硝基苯酚；6.2，4—二甲基苯酚；7.2—硝基苯酚；8.4—氯—三甲苯酚；9.2，4—二氯苯酚；10.2，4，6—三氯苯酚；11.五氯苯酚

（2）酚类化合物含量计算

利用保留时间定性，外标法定量，首先根据仪器中的标准曲线计算出处理后样品的浓度，再根据液—液萃取的浓缩倍数计算水样中样品的浓度［注意：原始样品经液-液萃取时进行了浓缩，从200mL浓缩到了1mL进样，计算时要考虑浓缩倍数］。

六、问题与讨论

1.为什么在进样分析前溶剂和样品要过滤？

2.简述设置梯度洗脱的目的。

3.紫外-可见光检测器与二级阵列管检测器有何异同？

七、注意事项

1.液液萃取时注意放气。萃取时，分液漏斗中有易挥发的有机溶剂，在振荡时挥发加剧，产生气体，气压增大，须振荡后放气，尤其在刚开始振荡时，要频繁放气。

2.在计算样品浓度时，请注意取样200mL 经过固相萃取后浓缩到了1mL 进样，根据外标法计算出浓缩后的样品浓度后，还需要根据浓缩倍数计算出样品实际浓度。