水体中氟喹诺酮类抗生素化合物的固相萃取和高效液相色谱分析

一、实验目的

了解固相萃取前处理方法的原理和基本处理步骤；掌握荧光检测器的基本原理及其适用范围；了解氟喹诺酮类抗生素在环境中的现存状态及分析方法；掌握高效液相色谱分析法的基本原理；掌握高效液相色谱仪的结构组成；了解高效液相色谱仪硬件及软件的相关操作；掌握参数设定，数据采集及数据分析。

二、实验原理与仪器结构

1.固相萃取

固相萃取（Solid-Phase Extraction，SPE）是一种基于液固分离萃取的预处理技术。该技术通过颗粒细小的多孔固相吸附剂选择性地吸附溶液中的被测物质，被测物质被定量吸附后，用体积较小的另一种溶剂洗脱或用热解吸的方法解吸被测物质，从而达到分离富集被测物质的目的。

2.高效液相色谱的原理

液相色谱和气相色谱一样，其分离系统由两相（固定相和流动相）组成。固定相可以是吸附剂，化学键合固定相，离子交换树脂或多孔性凝胶。被分离混合物由流动相液体推动进入色谱柱。根据各组分在固定相及流动相中的吸附能力、分配系数、离子交换作用或分子尺寸大小的差异进行分离。色谱分离的实质是样品与流动相以及固定相分子间的作用力的大小差异，决定色谱过程的保留行为。不同组分在两相间的吸附、分配、离子交换、亲和力或分子尺寸等性质存在微小差别，经过连续多次在两相间的交换，这种性质的微小差别被叠加、放大，最终得到分离。

液相色谱仪的工作过程：输液泵将流动相（经过在线过滤器）以稳定的流速（或压力）输送至分析体系，在进入色谱柱之前通过自动进样器将样品导入，流动相将样品带入色谱柱。在色谱柱中各组分因在固定相中的分配系数不同而被分离，并依次随流动相流至检测器，检测到的信号送至数据系统记录、处理及保存，如图5-11所示。

图5-11　高效液相色谱流程图

反相高效液相色谱（reversed phase HPLC）：流动相极性大于固定相极性的液-液色谱法称为反相色谱法。一般用非极性固定相，极性流动相，其代表性的固定相是十八烷基硅烷键合硅胶（C18）与辛烷基硅烷键合硅胶（C8），代表性的流动相是甲醇和乙腈。样品中极性大的组分先流出色谱柱，而极性小的组分后流出色谱柱，主要用于分离非极性或中等极性的分子型物质。

3.荧光检测原理

化合物受紫外光激发后，发射出比激发光波长更长的光，称为荧光。荧光涉及光的吸收和发射两个过程，被化合物吸收的光称为激发光，产生的荧光称为发射光。荧光的性质与分子结构有密切关系，不同结构的分子被激发后，并不是都能发射荧光。荧光的波长总要大于分子吸收的紫外光波长，通常在可见光范围内。

荧光强度与吸收光强度成正比。对于稀溶液，荧光强度与荧光物质溶液浓度、摩尔吸光系数、吸收池厚度、入射光强度、荧光的量子效率及荧光的收集效率等呈正相关，在其他因素保持不变的条件下，物质的荧光强度与该物质溶液浓度成正比，这是荧光检测器的定量基础。当考虑灵敏度时，测定波长应选择最大激发波长。

荧光检测最吸引人的特点是固有的灵敏度和选择性，它的最小检测限往往要比紫外检测低一个数量级以上。

4.环境中的氟喹诺酮类抗生素

氟喹诺酮类药物（FQs）是一类人工合成的广谱抗菌药，在临床上广泛应用于动物和人类的各种感染性疾病的治疗，诺氟沙星和环丙沙星等药物在全世界范围内广泛应用。在动物或人类用药后，FQs以原型或代谢物的形式随粪便、尿液等排泄物排除，残留于环境中。进入环境中的药物残留，在多重环境因子的作用，可产生转移、转化或在动植物中富集。目前在废水中已发现多种FQs，特别是诺氟沙星和环丙沙星，浓度分别为45～120ng／L，249～405ng／L。目前常用的分离检测方法有HPLC（VWD、PLD）、HPLC-MS。

三、实验条件

1.仪器设备

高效液相色谱仪（Agilent HPLC 1200，配稳压电源、四元泵、自动进样器、柱温箱），带荧光检测器，Agilent Chemstation色谱工作站。色谱柱：Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18，4.6×150mm，5μm。

固相萃取装置一套（包括所用到的工具），HLB小柱，Millipore纯水机，氮吹仪。

2.试剂与样品

氟喹诺酮类抗生素标准样品3个：氧氟沙星，诺氟沙星，环丙沙星（纯度大于99%）。甲醇（色谱纯），超纯水，无水硫酸钠，60～200目超纯硅胶，硅藻土，活性铜粉，磷酸，三乙胺，氨水，乙二胺四乙酸（Na2EDTA）。

3.测试参数

（1）进样：进样量为20μL，洗针进样，洗针液为纯甲醇。

（2）泵：流速为1mL／min；流动相为磷酸-三乙胺溶液缓冲液（磷酸浓度0.1%，用三乙胺调节pH=3.0）和甲醇，且缓冲液和甲醇的比例为80%∶20%，运行时间16min。

（3）柱温箱：柱温30℃；色谱柱：Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18，4.6×150 mm，5μm。

（4）荧光检测器：检测波长优化后梯度进行，见表5-6。

紫外检测器：检测波长为277nm。（供参考）

表5-6　氟喹诺酮类抗生素荧光检测波长梯度

四、实验步骤

1.试剂准备

磷酸-三乙胺缓冲盐：将1mL 磷酸加入1L 超纯水中（体积比约0.1%），再加入三乙胺调节pH 值至3.0，待用；6%氨水／甲醇洗脱剂：将氨水按6%的体积比稀释于甲醇中；5%甲醇溶液：将甲醇按5%体积比稀释到超纯水中；超纯水、甲醇：超声赶气泡。

2.样品准备

（1）标准样品配制

单标贮备液：准确称取5.0mg固体标准品溶于50mL 容量瓶，甲醇定容（或用pH 为3.0的甲酸溶液溶解），配制100mg／L的标准储备液，转移至棕色瓶，于4℃冰箱保存。

混合标准液：移取一定体积的标准液，用初始流动相（磷酸-三乙胺∶甲醇=80%∶20%）稀释并定容，配制成1～10μg／mL浓度的标准工作液。

（2）样品前处理——固相萃取(www.xing528.com)

取250mL水样，过0.45μm 滤膜，用磷酸或甲酸调节pH 值为3.0 左右，加入0.3g Na2EDTA（浓度为1.2g／L）。装上HLB萃取小柱（200mg，6mL），小柱依次用10mL 甲醇和10mL超纯水活化，然后使水样通过HLB 小柱，流速控制在5 mL／min 左右，再用5mL 5%甲醇溶液淋洗，负压抽10min，最后用6mL 6%的氨水／甲醇洗脱剂洗脱，收集洗脱液。洗脱液在35℃水浴氮吹至小于200μL，用初始流动相定容至1mL。

3.仪器准备

（1）检查流动相，仪器线路，废液瓶等是否准备妥当；

（2）打开电脑，HPLC各组件电源，打开工作软件。

（3）打开工作界面，按操作要求赶流动相气泡。排气：打开“purge”（冲洗）阀，点击“pump”（泵）图标，点击“setup pump”（泵参数设置）选项，进入泵编辑画面，设定“flow”（流速）为5mL／min，点击“OK”。点击“pump”（泵）图标，点击“pump control”（泵控制）选项，选中“on”，点击“OK”，则系统开始冲洗管路，直到管线内（由溶剂瓶到泵入口）无气泡为止，切换通道（a-b-c）继续冲洗管路，直到所有待用通道无气泡为止。点击“pump”（泵）图标，点击“pump control”（泵控制）选项，选中“off”，点击“OK”关泵，关闭“purgevalve”（冲洗阀）。点击“pump”（泵）图标，点击“setup pump”（泵参数设置）选项，设定“flow”（流速）为1.0mL／min。

（4）配置仪器（配置1100／1200系统模块，选择需要的模块，主要选择需要的检测器），建立平衡柱子的分析方法，保存并运行。

（5）按测试参数设置标准样品分析方法（供参考，可根据仪器及柱型进一步优化）并保存待用。

2.上机分析

（1）待色谱柱平衡后，设置进样程序（sequence），选择标准样品分析方法、设置进样位置、次数等；设置数据保存路径。

（2）运行标准样品进样程序，开始分析标准系列样品。

（3）得到3个氟喹诺酮类抗生素的色谱图，并对色谱峰进行积分，根据标准样品的浓度和峰面积建立外标曲线，并将其保存到方法中。

（4）按标准样品分析方法，建立未知样品进样程序，分析得到样品色谱图。

（5）分析结束后，建立清洗及保存柱子的方法并运行。

（6）所有程序结束后，关泵、关灯，退出程序，关闭主机、电脑及相关附件。

五、实验结果与数据处理

1.实验记录

原始数据记录：记录实验步骤，实验条件，仪器参数，列表记录原始测试结果（标准溶液浓度、信号值以及样品的信号值）。

2.实验结果

（1）参考色谱图（图5-12）

图5-12　3个氟喹诺酮类抗生素在给定的色谱条件下的色谱图

（2）氟喹诺酮类抗生素含量计算

利用保留时间定性，外标法定量，首先根据仪器中的标准曲线计算出处理后样品的浓度（Ci），再根据固相萃取的浓缩倍数计算水样中样品的浓度（Ci水）［注意：原始样品经固相萃取时进行了浓缩，计算时要考虑浓缩倍数（250）］。

式中　Ci——根据标准曲线计算出处理后的样品中抗生素i的浓度；

　　　Ci水——实际水样中抗生素i的浓度；

　　　250——浓缩倍数。

六、问题与讨论

1.简述高效液相色谱分析的特点及应用范围。

2.流动相使用前为什么要脱气？

3.高效液相色谱与气相色谱有何异同点？

七、注意事项

1.请用棕色溶剂瓶盛放新鲜超纯水和磷酸盐缓冲液，以避免在光照和长期存放情况下，水和缓冲盐溶剂瓶内长藻，从而堵塞溶剂过滤器，影响泵的运行。

2.开机排气泡时，建议以5mL／min的流速运行10min，保证气泡充分赶尽，以防止在洗脱过程中产生气泡进入系统，影响分析结果。

3.在液相色谱分析中，定量多采用外标法，建议用等比例稀释法配制标准曲线，以确保标准样品的浓度点均匀分布，同时注意标准曲线浓度范围应涵盖测试样品的浓度。

4.流动相中使用了缓冲盐，需要配制10%异丙醇清洗泵头，具体操作是在软件上开启泵的同时，开启“seal-wash”（泵清洗）的定时清洗。在测试结束后，充分清洗管路和色谱柱，切勿将缓冲盐留在系统和色谱柱中。同时，当次用不完的缓冲盐，请勿留在溶剂瓶中。

5.在计算样品浓度时，请注意取样250mL 经过固相萃取后浓缩到了1mL 进样，根据外标法计算出浓缩后的样品浓度后，还需要根据浓缩倍数计算出样品实际浓度。

6.在进行样品处理时，需要进行加标回收和空白对照试验，以确保方法的准确性。