测定污泥发酵液中挥发性有机脂肪酸含量的气相色谱实验

一、实验目的

掌握气相色谱的基本原理、组成结构及作用；了解氢火焰离子化检测器的特点和使用方法；掌握气相色谱中利用保留时间定性的方法，以及外标定量方法；了解利用极性毛细管柱测定极性有机物的注意事项。

二、实验原理与仪器结构

1.气相色谱工作原理及仪器结构

利用试样中各组分在气相和固定相间的分配系数不同，当汽化后的样品被载气带入色谱柱中后，组分就在两相间进行反复多次分配或吸附／解附。由于固定相对各组分的吸附或溶解能力不同，各组分在色谱柱中的运行速度就不同。经过一定的柱长后，各组分便彼此分离，按顺序离开色谱柱进入检测器，产生的离子流讯号经放大后，在记录器上得出各组分的色谱峰。

气相色谱仪一般由载气系统，进样系统，分离系统，检测系统和记录系统组成，结构示意图如图5-2所示。

图5-2　气相色谱仪结构示意图

（1）载气系统（E，F）：包括气源、气体净化、气体流速控制，提供稳定流量／压力的高纯载气。

（2）进样系统（A）：包括注射器和进样口（隔垫、衬管），样品被注射器注入衬管后（液体样品瞬间汽化），被载气带入色谱柱，分流功能也在进样口实现。

（3）分离系统（B）：包括色谱柱和柱温箱，在恒温或程序升温控制下，样品中各组分在色谱柱中实现分离。

（4）检测系统（C）：由检测器获得与各组分含量呈比例的信号。

（5）记录系统（D）：包括数据处理装置及工作站（较早型号的仪器配置的是放大器和记录仪），记录检测器获得的信号，得到色谱图，并可以对色谱峰进行积分等处理。

2.氢火焰检测器（FID）的工作原理

含碳有机物在氢火焰中燃烧时，产生化学电离，发生下列反应：

（1）CnHm→·CH；（2）·CH+O＊→2CHO++e-；（3）CHO++H2O→H3O++CO

在电场作用下，正离子被收集到负极，产生电流。

检测器结构如图5-3所示，在喷嘴上加一极化电压，氢气从管道7进入喷嘴，与载气混合后由喷嘴逸出进行燃烧，助燃空气由管道6进入，通过空气扩散器5均匀分布在火焰周围进行助燃，补充气从喷嘴管道底部8通入。

图5-3　FID检测器结构示意图

3.气相色谱保留时间定性

在混合物样品得到分离之后，利用已知物保留时间对各色谱峰进行定性是色谱法中最常用的一种定性方法。它的依据是在相同的色谱操作条件下，同一种物质应具有相同的保留时间。当已知物的保留时间与未知物组分的保留时间完全相同时，则认为它们可能是相同的化合物。这个方法是以各组分的色谱峰必须分离为单独峰为前提，同时还需要有作为对照的标准物质。

4.气相色谱外标法定量

色谱定量分析的依据是被测物质的量与其在色谱图上的峰面积（或峰高）成正比。数据处理软件（工作站）可以给出包括峰高和峰面积在内的多种色谱数据。因为峰高比峰面积更容易受分析条件波动的影响，且峰高标准曲线的线性范围也较峰面积的窄，因此，通常情况是采用峰面积进行定量分析。

外标法是色谱分析中基本的定量方法。当样品中所有组分都得到良好的分离并都能被检出而得到色谱峰时，则可利用外标法定量计算样品中各组分的浓度。要求标准样品和未知样品在同样条件下分析，进样量准确（最好用自动进样器），只需对分析的组分峰作校正，绘制待分析组分的浓度或绝对量对该色谱峰面积的校正曲线，计算未知样中该组分浓度或绝对量。根据情况可作单极校正或多级校正。

5.极性毛细管气相色谱柱

待测物为环境样品中需要监测的VOCs，六种挥发性有机酸时，由于其属于极性物质，所以选择极性色谱柱DB-WAXetr，其固定相是强极性聚乙二醇（PEG）最高使用温度240℃。

三、实验条件

1.仪器设备

气相色谱仪（Agilent 6890N），带氢火焰离子化检测器，100位自动进样器。色谱柱：J&W DB-WAXetr（30m×0.53mm×1μm）；载气：高纯氮气；燃烧气：高纯氢气；助燃气：高纯空气。

2.试剂与样品

（1）标准样品：含乙酸、丙酸、正丁酸、异丁酸、正戊酸、异戊酸的混合标准样品储备液，每种组分浓度均为10g／L。

（2）待测水样：污泥发酵液样品多个，约10mL。(www.xing528.com)

（3）3%磷酸10mL。

气相色谱2mL进样瓶，2mL针筒，水样过滤头，4mL 离心管若干，移液枪及一次性枪头若干。

3.测试参数

进样量0.5 μL；不分流进样口200℃；分流吹扫30 mL／min，0.75 min，恒流6.4mL／min；柱温55℃，1min，30℃／min升至110℃，1min，10℃／min升至200℃，0min，30℃／min 升至 220℃，1min；FID 220℃；H2 40mL／min，Ar 400mL／min，尾吹N225mL／min。

四、实验步骤

1.标准溶液配制（现配现用）

用移液枪配制乙酸，丙酸，正丁酸，异丁酸，正戊酸，异戊酸六种混合物水溶液1mL 于2mL色谱样品瓶中，浓度分别为20mg／L，40mg／L，60mg／L，80mg／L，100mg／L。

2.样品预处理

将待测污泥发酵液样品，离心6 000r／min，取上清液过0.45μm 滤膜，稀释50～100倍，取1.5mL于2mL色谱样品瓶中，再加入3%磷酸100μL（pH 为2～3），盖好中空色谱瓶盖，摇匀待测。

3.仪器准备

（1）通氮气约1min后，打开氢气和空气钢瓶减压阀。

（2）打开稳压电源，打开气相色谱仪主电源，打开电脑及工作站。

（3）设定柱温，进样口温度和检测器温度分别为55℃，200℃和220℃。

（4）当温度达到设定值后，在工作站中设定分析文件名、文件路径和仪器方法，等待仪器显示“ready”（准备）。

4.上机分析

（1）按照空白，标准样品（从低浓度到高浓度），待测样品（按序号）顺序在自动进样器上排列，在工作站软件上设定分析序列，点击“运行序列”开始自动进样测试。

（2）测试结束后，对每个色谱图进行积分处理，并记录所有数据。

（3）启动降温程序，待柱温、进样口温度和检测器温度均降至50℃以下后，依次关闭化学工作站、气相色谱仪，关闭气体钢瓶及稳压电源。

五、实验结果与数据处理

图5-4是六种典型挥发酸的色谱图，根据已知标样的保留时间定性，峰1～6的六个峰为目标峰。

记录标准样品中每个组分的峰面积，作出各组分以峰面积和浓度为坐标的外标法标准曲线图。

根据未知样品色谱图中相应色谱峰的峰面积，计算所测样品中相关组分的实际含量。

图5-4　六种挥发性有机脂肪酸在WAXetr色谱柱上出峰图

注：1—乙酸；2—丙酸；3—异丁酸；4—正丁酸；5.异戊酸；6.正戊酸

六、问题与讨论

1.氢火焰离子化检测器与其他常见的检测器相比优势在哪些方面？

2.分流／不分流进样口的进样过程分别是什么？

七、注意事项

1.配制标准溶液时，储备液浓度较高，可以先配一个中间液，如1 000mg／L，再逐级稀释至所需浓度。

2.根据污泥发酵液的实际情况进行稀释。对情况不明的未知水样，可先大倍数稀释，稀释样品进行预实验，再根据结果确定稀释倍数。

3.使用单标在同一条件下多次进样，逐一确定保留时间，也可用标准加入法确定保留时间；可根据目标物的沸点辅助判断多种目标化合物的出峰顺序。