PCR实验的关键注意事项

作为科学家，笔者做过许多PCR实验。 这儿笔者想谈谈自己的经验，给读者作参考。

PCR的最大特点就是极高倍数的DNA扩增。 极其微量的DNA经过PCR就变成显著多的量。 因此，PCR实验的第一个、也是最基本的要求，就是要保证你所扩增的DNA确实是你想要扩增的，没有你不要的东西，也就是说必须绝对避免污染。 在做系列PCR即同时做许多样品的PCR时，这种局面特别严峻，大多数PCR实验失败都是因为污染。 而要避免污染，首先我们要养成良好的个人卫生习惯。 有些研究生因为工作忙，往往忽视个人卫生，虽然情有可原，却是对工作不利。 要注意实验室整体的清洁卫生，而且打扫要用湿的拖把等工具，不能扬起灰尘。 尤其是实验台，必须每天擦拭。 有的人喜欢在实验台上铺纸，在纸上做实验，纸下有多脏也不管，这是不好的。 整个实验环境的清洁，是实验成功包括避免污染的最基本条件。 第二，要养成严格、准确的操作习惯。 做PCR必须戴一次性使用的手套，如手套有污染要立即更换。 使用微量移液器吸取样品和反应液时，手的用力要适当，不要猛力按移液器活塞，避免造成误差。一支吸液头只能用一次，绝对不可粗心大意忘了换吸液头。 特别注意吸液量不要过多，绝对不能使吸上的液体沾到移液器尖端上！ 否则，这支移液器不能再用！ 只有仔细清洗干净后才能用。 这种清洗非常麻烦，所以最好是使用PCR专用的移液器和吸液头，这种移液器和吸液头带有特殊构造，能有效地防止样品溶液污染。 此外PCR实验所用的一切容器如反应管（离心管）、试剂瓶等，都必须仅供PCR专用，必须是足够清洁，例如玻璃瓶要经过重铬酸钾浓硫酸洗液的浸泡，再先用普通蒸馏水、然后用三次重蒸水多次彻底洗净。 为避免清洗的麻烦，最好所有容器都使用市售的PCR专用品。 要注意的是，使用PCR专用的实验器材并不能保证杜绝污染，防止污染的根本条件是实验环境的清洁和实验人员操作的严格规范。

PCR实验是一种高精密度的实验，因此仔细的实验设计是极其必要的。 每个PCR都必须设有对照，对照包括含已知样品的正对照和不含待扩增模板或不含引物的负对照，以及各该实验所有的特殊对照；DNA分子量标准也是必需的。 引物要设计得当，最好用“in silico（计算机上）”的模拟PCR来事先检验引物是否能用。 在实验设计上多花点功夫，是聪明的选择，多动脑筋往往能避免在实验中浪费太多的时间。 上面讲过，设计引物是实验最关键的一步，一定不能掉以轻心。

待扩增的DNA样品的准备也是必须注意的。 这些样品最好先经过DNA提纯一步，用经过提纯步骤的样品液来做PCR。 不过，样品总量经常极小，所以在很多情况下会把样品直接拿来做PCR；这时如可能，最好在反应液中添加能去除或减少样品杂质对PCR的不利影响的物质。 幸好绝大多数杂质蛋白都是怕热的，PCR中的95℃加热足够使它们变性失活，不至于影响PCR。

做PCR时要注意的事情还有很多，这本小书里说不完，读者朋友们如果现在或今后有机会从事PCR工作，最好的办法还是亲自去做一做PCR，在实践中体会这种技术的神奇和实验操作准确的重要性。

PCR已经成为推动科学特别是生命科学发展的一个重要手段。 许多理论科学和应用科学的发明、发现，是与PCR技术紧密联系在一起的。现代的生命科学和应用科学，虽然已经有了强劲的进步，有了令人振奋的许多发现，但是还像几百年前物理学家牛顿说过的那样，只是在海边上捡了几个闪光的贝壳。 我们还没有发现的东西要比已经发现的东西多不知多少倍。 因此，科学家们还必须利用可能利用的一切研究手段，包括PCR，来继续探讨自然界和生命的秘密；也需要有志于科学的人士，特别是青年，在探索宇宙和生命的奥秘上贡献一生。 而利用PCR进行前人从未做过的工作，探索前人从未了解甚至未能理解（像100多年前人们不能理解孟德尔一样）的科学规律，必将是极其有意义的。(www.xing528.com)

如果你从事的是前人从未做过的探索工作，且有足够理由（足够的实验事实）坚信自己的途径、方向是正确的，那么就应该坚持，目不旁骛、全力钻研，即使困难重重、多次失败也毫不退缩，即使暂时没出成果遭同事讥笑、领导责难也不屑一顾！ 当你的研究得到国际科学家的印证、最终获得别人想象不到的成功，你的论文登载在有名的国际科学杂志上时，伴随着同事的惊叹，将是你作为一个真正的科学家的无比自豪和快乐！

［参考文献］

1.K Mullis，F Faloona，S Scharf，et al.Specific enzymatic amplification of DNA in vitro：the polymerase chain reaction［J］.Cold Spring Harb Symp Quant Biol.1986，51 Pt 1：263-273

2.RK Saiki，DH Gelfand，S Stoffel，et al.Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase［J］.Science.1988，239（4839）：487-491

3.S Kwok，DH Mack，KB Mullis，et al.Identification of human immunodeficiency virus sequences by using in vitro enzymatic amplification and oligomer cleavage detection［J］.J Virol.1987 May；61（5）：1690-1694