PCR步骤：DNA聚合酶在复性阶段的关键作用

PCR中起主导作用的是DNA聚合酶。 因此，我们使用的DNA聚合酶的特性就决定了PCR的条件。

现在PCR实验最常用的还是赛基和莫里斯等使用的、老牌的耐热DNA聚合酶——Taq DNA聚合酶。

这个酶进行DNA复制的最适温度在70℃左右，最高能耐98℃。 一般综合考虑到使酶能保持较长时间的活力，又能保证DNA合成的专一性，把合成反应的温度定在68～72℃。 不过，近年来，市场上出现了各种各样的耐高温的DNA聚合酶，有把Taq DNA聚合酶分子经过基因工程改造得到的，也有用别的耐热菌像“嗜热栖热菌（Thermus thermophilus）”提取的，各有自己的适用温度和其他反应条件，可供研究工作者选用。

如上所说，PCR就是一连串的DNA合成反应。 引物在适当的复性温度下与单链DNA模板专一地结合，形成双链区和单链区。 DNA聚合酶就结合在双链和单链交界的地方，进行DNA的合成，直到全部模板都成为双链。 然后，我们就要提高反应温度，使刚刚合成的双链打开成为单链；接着降低反应温度到引物的复性温度，使引物再在互补位置与单链DNA结合。 引物复性温度比DNA聚合酶“工作”的最适温度低得多，所以我们又要提高反应温度到DNA聚合酶的“工作”温度，使复制反应再进行一次。 还有一点要注意的是，当PCR刚开始的时候，我们希望所有DNA模板都是单链状态，因此要对反应液作短时间的高温加热。

聪明的读者可能会提出一个问题：已经合成好的DNA双链一定比引物长得多，那么前者的复性温度一定也比引物高。 那么，在温度降低过程中，还没有达到引物的复性温度时，合成好的DNA双链不是会“抢先”复性吗？ 那怎么保证DNA单链是和引物结合而不是和另一条已合成好的DNA单链重新结合呢？ PCR反应又怎么能继续进行呢？

这的确是一个很重要的问题。 如果在复性阶段两条DNA长链重新结合，肯定会妨碍PCR的继续。 而且在PCR的后期，当合成的DNA已经很多的时候，确实可能出现这样的情况，使得PCR出问题。

关键在于我们做PCR时，需要扩增的DNA的量是极少的，而引物的量是很多的。 举个例子，一般PCR反应液（50微升）中的待扩增DNA的量是5微克，引物的浓度是2×10-7摩尔浓度。如果待扩增的是人的基因组的单链DNA（约3×109碱基，即克摩尔量约1012克）的话，5微克相当于5×10-18摩尔浓度，那么这DNA在PCR反应液中的浓度就是约10-13摩尔浓度。你看，引物分子的浓度比待扩增DNA分子的浓度大2×106倍！ 因此，在PCR的复性阶段、反应液温度降低的时候，已合成的DNA分子相互碰撞的可能性是微乎其微的。 DNA单链几乎只能与引物分子相互碰撞和结合，这就是PCR能进行许多个循环的原因。 当然，我们这里只是粗略地估计一下。

因此，PCR的步骤是这样的：

（1） 加热，95℃，30秒至1分钟。(www.xing528.com)

（2） 降温到复性温度，此温度由所设计的引物决定，一般在50～55℃，30秒。

（3） 升温到DNA聚合酶的工作温度，如68℃，1～3分钟。

（4） 加热，95℃，30秒。

（5） 按步骤（2）至（4）进行。

（6） 重复步骤（4）到（5）20～30次。 最后一次不再加热到95℃，而是在68℃继续保温5分钟，以保证新合成的DNA分子全部是全长的。

PCR是否成功，一般是用琼脂糖凝胶电泳检查。 琼脂糖就是我们有时在食品店能买到的“洋菜”，可以做成胶冻；当然用来搞科研的要纯得多。 拿琼脂糖加热溶在适当的pH中性缓冲液里，再加1微克/毫升的荧光染料溴乙锭（Ethidium bromide，EB）。 这样的胶液冷凝后就变成半透明的“冻胶”。 把这冻胶放进装好缓冲液的电泳装置，把DNA溶液加到冻胶上预先做好的样品槽里，再在两头通上直流电。 胶里的DNA分子就会慢慢“游”向正极（为什么不游向负极？ 请读者想想——笔者注），边游动边和溴乙锭分子结合。 DNA分子量越小，游动就越快。 DNA溶液中还加了一种带负电荷的蓝色染料——溴酚蓝，它比大多数DNA分子都跑得快，等溴酚蓝接近正极，电泳就完成了。 电泳后，取出琼脂糖凝胶，放到紫外灯下，胶里的DNA分子就会发出美丽的橙红色荧光。

但是你要当心，溴乙锭是致癌化学品，你做实验一定要戴手套，而且一定不要让含溴乙锭的废液粘到皮肤上！ 用过的废液要适当处理使溴乙锭分解后，才能倒入下水道。 不过现在已经有了不致癌的荧光染料，可以代替溴乙锭来做PCR的电泳检查，不过价钱较贵。

还有一件事，琼脂糖凝胶像鱼一样滑，你拿它时一定要十分小心，别让它滑出手掉地上摔碎！ 这是不少研究生犯过的错误。 因此，你做DNA电泳时只能用极少的样品，千万不要一次把样品都加光了，不然这次电泳没做好的话，连再做电泳的机会都没有了！