基因工程技术与重组多肽的体外功效性评价

体外功效性评价是一种替代活体动物进行试验，以单细胞生物、微生物或细胞、组织、器官甚至电脑模拟等方法对化妆品产品或原料进行评价的方法，包括理化分析法、生物化学方法、细胞生物学方法、分子生物学方法等。

（一）皮肤屏障修复类多肽功效评价

皮肤表皮层和真皮层中的干细胞、committed-progenitor（CP）细胞、transitamplifying（TA）细胞、终末角质形成细胞与成纤维细胞的增殖、分化，共同维持皮肤微环境的平衡与稳定状态。内外源压力条件，如外力损伤、年龄、炎症、紫外线、化学物质刺激等都会破坏皮肤稳定状态，导致皮肤屏障功能的降低。

1.皮肤细胞模型修复皮肤屏障功效评价　角质形成细胞是表皮的主要细胞，对皮肤的结构和功能起重要的作用。角质形成细胞在向上分化形成皮肤屏障的过程中，不同的结构蛋白会特异性分布在皮肤的各层中。聚丝蛋白（filaggrin，FLG）、兜甲蛋白（loricrin，LOR）、角质转谷氨酰胺酶（TGM1）是角质形成细胞分化晚期的关键结构蛋白，和屏障功能的强弱密切相关。以角质形成细胞作为预测模型，用免疫荧光法、RT-PCR 检测皮肤屏障相关基因（FLG、LOR、TGM1）和表皮紧密连接相关基因的表达，可以评价产品或活性物修复皮肤屏障的功效。另外，角质细胞或人皮肤成纤维细胞黏附试验可评测产品或活性物维持细胞形态结构与功能的能力，细胞划痕实验可以评测产品或功效物对于伤口愈合的促进能力。

2.3　D 皮肤模型修复皮肤屏障功效评价　3D 皮肤模型按照复杂程度分为表皮模型、真皮模型和全层模型三种。表皮模型是将人表皮角质形成细胞（human epidermal keratinocyte，HEK）培养在胶原或其他生物材料构成的支架上或由人皮肤成纤维细胞（HSF）组成的饲养层细胞上；真皮模型将HSF 培养在胶原等生物材料构成的支架上；全层模型主要由表皮层、真皮层和细胞外基质层（含胶原纤维）构成，含分层培养的HEK 和HSF。自1979 年首例含有功能性表皮层的皮肤模型构建以来，已经有多款皮肤模型在体外构建成功并商品化，包括法国的EpiSkin、Skin Ethic RHE，美国的EpiDerm，德国的epiCS，日本的LabCyte EPIMODEL，以及中国的EpiKutis（图4-4）。

图4-4　3D 皮肤模型EpiKutis 的组织学结构

产品或活性物暴露于3D 皮肤模型后，通过其上调有利于皮肤屏障功能增强的生物指标表达，判定化妆品促屏障功能增强的潜力。例如，在活性物皮肤屏障增强功效评价试验中，利用免疫荧光技术对不同处理条件下的3D 皮肤模型EpiKutis 进行FLG、LOR、TGM1 蛋白水平分析，或用高效液相色谱-质谱联用技术（LC-MS）对皮肤屏障脂质含量进行分析。在利用皮肤模型评价活性物的舒敏修复功效时，可将其作用于经表面活性剂或微生物等刺激后的3D 皮肤模型上，通过检测活性物对刺激后皮肤模型组织活力的影响，炎症介质（PGE2）和炎症因子（如IL-1α、IL-8 和TNF-α等）的分泌情况，以及相关基因的表达情况来评估活性物的抗炎修复能力。

（二）抗老化类多肽功效评价

抗老化类多肽化妆品主要强调抗皱、增强皮肤抗氧化能力、减缓皮肤中水分的丢失速度以及提高细胞增殖率等功效。这些功效通过特定添加物作用于角质形成细胞和成纤维细胞及其中所含蛋白质来实现。

1.成纤维细胞模型抗衰老功效评价　人皮肤成纤维细胞（HSF）是皮肤真皮层的主要效应细胞，由胚胎时期的间充质干细胞分化而来，能合成和分泌胶原蛋白、纤维连接蛋白、层连蛋白和透明质酸等细胞外基质。同时还有趋化性和黏附性，对维持皮肤的弹性和韧性具有重要作用，HSF 的数量减少是皱纹产生的重要原因。细胞生物学相关检测方法主要有细胞增殖试验、胶原蛋白合成试验、胶原蛋白酶抑制试验、弹性蛋白酶的活性抑制试验、RT-PCR 检测细胞外基质相关基因表达试验、Western Blot检测细胞Ⅰ型胶原蛋白和MMP-1 分泌量试验、2'，7'-二氯荧光黄双乙酸盐（DCFH-DA）检测细胞ROS 试验、Hoechst-PI 双染法检测细胞凋亡试验、衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）活性检测等。

2.角质形成细胞模型抗衰老功效评价　角质形成细胞是表皮的主要细胞，此类细胞经过增殖和分化，最终形成包括基底层、棘层、颗粒层及角质层的表皮复层结构。人永生化角质形成细胞Hacat 是非肿瘤来源的人正常皮肤角质形成的永生化细胞株，较易于培养及传代。目前Hacat 细胞株已被广泛应用于化妆品的抗衰老、抗氧化及透皮研究中。抗衰老、抗氧化相关检测方法主要有细胞活力和细胞划痕实验、流式细胞术检测ROS 试验、ELISA 检测炎症介质（PGE2）试验和比色法检测SOD 含量试验等。(www.xing528.com)

3.3　D 皮肤模型抗衰老功效评价　真皮在皮肤老化过程中的改变包括萎缩以及结构变化。在构建的3D 全层皮肤模型中，如法国的T-Skin、美国的EpiDerm FT、德国的Phenion FT，以及中国的FulKutis 等，来自乳头真皮和深真皮层的成纤维细胞具有不同的体外增殖以及合成细胞外基质的能力。3D 全层皮肤模型满足了真皮研究应用的需求，可以模拟皮肤老化的过程，检测一些主要的皮肤衰老相关蛋白质合成的变化，可以研究皮肤程序性、外源性老化过程中的生物学机制，并发现有利于皮肤抗衰的化妆品活性成分。

值得注意的是，3D 皮肤模型也被用于体外抗衰老功效检测。在3D 皮肤模型上评价抗皱剂等的功效性，与单层细胞培养相比更接近于生物体的真实状态，可以用于毒性分析和功效测试，是保证化妆品安全功效的重要手段。测试时将活性物质配制成膏霜等剂型，涂于重建皮肤模型上，通过检测相关指标，如清除自由基能力、抗氧化能力和胶原蛋白含量，可以考察产品或活性物质对细胞增殖分化及抗衰老、抗氧化能力的影响。

4.生物化学试验抗衰老功效评价　自由基过量是导致皮肤自然老化和光老化的主要影响因素，因此抗衰老评价的主要指标之一就是自由基清除能力。当特定自由基产生源（Fenton 反应产生的羟自由基、人工合成的DPPH 自由基、AAPH 产生过氧化氢自由基等）与指示剂反应时，体系中的自由基会使指示剂信号减弱。抗氧化测试方法测定的是活性成分保护指示剂的能力。目前清除DPPH 自由基、羟自由基、超氧阴离子自由基（O2-）等最常见。这类生物化学方法操作简便、技术成熟、反应快速，是测试抗衰老的基本方法。

5.保湿抗衰老功效评价　皮肤能维持一定的含水量和角质层内外的水平衡，对于抵抗由内外因素造成的皮肤干燥，防止皮肤老化都具有重要意义。皮肤真皮层含水量降低将导致胶原纤维断裂并影响弹力纤维的弹性，从而导致皮肤粗糙，弹性下降，皱纹增多。同样，若真皮层中的透明质酸、黏多糖等大分子物质受到破坏亦会导致皮肤结合水分的能力受损。因此，保湿活性也是评价抗老化产品功效的检测指标。

人体皮肤保湿功能的发挥主要依赖皮肤的生理结构，可分为主动保湿和被动保湿。皮肤中的天然保湿因子（NMF）、水通道蛋白（AQP3）扮演着吸水和生水的角色，属于主动保湿。皮肤屏障包括皮肤表面的皮脂膜和角质细胞、细胞间的结构脂质（神经酰胺、脂肪酸和胆固醇）。表皮中的聚丝蛋白分解形成天然保湿因子以及氨基酸和糖类分子，这些可以起重要的锁水功能，属于被动保湿。

基于保湿的原理，化妆品保湿功效的体外评价方法包括理化分析法、细胞生物法（包括3D 皮肤模型）。理化分析法采用称重法评判化妆品的吸湿性和保湿性，或对化妆品中的保湿活性成分进行定量分析。功效物对皮肤天然保湿因子生成的促进作用是体外评价保湿功效的重要指标。以人皮肤角质细胞作为评估体系，通过RT-PCR 和免疫荧光法检测水合相关基因和蛋白（如AQP3、FLG、LOR）、屏障/紧密连接相关基因的表达，可以评价功效物对天然保湿因子的合成及水分运输的影响。另外，结合3D 表皮模型，通过HPLC 分析天然保湿因子（如透明质酸、PCA或UCA）的含量、屏障/紧密连接相关基因和蛋白以及脂类成分的变化，可以多维度评估原料、成品的保湿能力。

（三）美白类多肽功效评价

黑色素的生成以及运送过程发生在人体表皮的黑色素细胞和角质形成细胞中，黑色素也是皮肤中色素含量及分布的决定因素，决定了皮肤的颜色。美白类多肽的体外功效评价方法包括美白成分仪器分析法、酪氨酸酶抑制试验法、黑色素生成抑制试验法、3D 黑色素皮肤模型等。

1.体外酪氨酸酶抑制试验　酪氨酸酶作为黑色素合成途径中的主要限速酶，通过作用于酪氨酸并转化成多巴，多巴随后氧化为多巴醌来影响黑色素生成。酪氨酸酶活性检测方法包括放射性同位素法、免疫学法和生化酶学法，其中生化酶学呈色法最为常用。此外，角质细胞黑色素摄取试验也是一种评价美白作用的新方法。

2.黑色素细胞系美白功效评价　体外培养的小鼠B16 黑色素瘤细胞，可以通过荧光倒置显微镜、激光共聚焦显微镜及拉曼成像工作站等观察活性物对细胞的存活形态及黑色素合成量变化的影响。黑色素细胞原位酪氨酸酶活性测定法、同位素测定法、功效添加剂与黑色素细胞共培养测定法等可以检测美白添加剂对细胞内酪氨酸酶活性的抑制效果。

3.3　D 黑色素皮肤模型美白功效评价　早在20 世纪90 年代初期，黑色素细胞就被用于制备3D 皮肤模型并对角质形成细胞和黑色素细胞之间的相互关系进行了研究。目前已有多款3D 黑色素皮肤模型在体外构建成功，如法国的SkinEthic RHPE、美国的MelanoDerm、德国的EPICS-M 以及中国的MelaKutis，它们通常含有5%～10%不等比例的黑色素细胞，生长于3D 黑色素皮肤模型的基底层，随角质形成细胞复层化形成表皮结构。通过对比美白类活性物给药前后3D黑色素皮肤模型表观、L* 值、黑色素含量变化等，可以对美白产品进行全面、多维度的科学检测。另外，由于3D 黑色素皮肤模型与皮肤结构和功能高度类似，其也可用于评估防晒霜的功效。