基因工程技术：多肽含量分析方法

（一）化学法

1.双缩脲法　在强碱性溶液中，双缩脲与硫酸铜形成紫红色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能通过一个中间碳原子相连的肽键的化合物都有双缩脲反应。当多肽含量越高时，紫红色络合物颜色越深。按倍比稀释的多肽标准品，与双缩脲试剂混合处理后，于540 nm 处测定其OD 值，可得一条标准曲线及公式，随后将样品经过处理后得到的OD540 值代入标准曲线公式，即可得知多肽样品的多肽浓度。该方法经济、简便、测定结果准确、重复性好。

2.福林-酚试剂（Lowry）法　Lowry 法的显色原理与双缩脲法是相同的，只是加入了第二种试剂，即福林-酚试剂，以增加显色量，相比双缩脲法而言，其检测多肽或蛋白质的灵敏度更高。这个方法的优点是灵敏度高，缺点是费时，要严格控制操作时间，标准曲线也不是严格的直线形式，且专一性较差，干扰物质较多，如某些氨基酸、兼性离子缓冲液、非离子表面活性剂、蔗糖、含硫化合物等。

3.二喹啉甲酸法（BCA 法）　该方法是美国的Smiths 等在1985 年对Lowry法的一种改良。反应原理：蛋白质将二价铜离子还原成亚铜离子，后者在碱性条件下与BCA 络合生成紫红色络合物；此化合物在540～590 nm 有最大吸收波长，反应物的颜色和蛋白质浓度在一定范围内具有线性关系。该测定方法操作方便、检测灵敏度高、线性范围宽、受蛋白质标准品的影响较小。BCA 法对NaCl、NaOH 和SDS 等蛋白提取溶剂有一定的耐受性，但蔗糖、尿素、EDTA（乙二胺四乙酸）等对该测定方法有一定干扰作用。

4.凯氏定氮法　该方法由丹麦化学家凯道尔于1883 年建立，是分析有机化合物含氮量的常用方法。由于蛋白质中的含氮量通常占其总质量的16% 左右（12%～19%），因此，通过测定物质中的含氮量便可估算出物质中的总蛋白质含量（假设测定物质中的氮全部来自蛋白质），即蛋白质含量=含氮量/16%。利用该方法检测多肽含量与此同理。在有催化剂的条件下，用浓硫酸将样品的有机氮都转变成无机铵盐，然后在碱性条件下将铵盐转化为氨，蒸馏出来并为过量的硼酸溶液吸收后再以标准盐酸溶液滴定，就可计算出样品中的含氮量。该方法准确度高、干扰因素少，但前提是要排除所有非多肽或蛋白氮的干扰。

（二）染料结合法(www.xing528.com)

1.考马斯亮蓝法　又称Bradford 法。在酸性条件下，考马斯亮蓝G-250 染料与多肽或蛋白质疏水区结合，颜色由棕色变为蓝色，该蓝色化合物颜色的深浅与多肽或蛋白质浓度的高低成正比；最大吸收峰也由465 nm 变为595 nm，其光吸收值与多肽或蛋白质含量成正比。将按倍比稀释的多肽标准品与Bradford 试剂混合，测量在595 nm 处的吸收值，即可建立一条由一系列梯度稀释的多肽标准品的标准曲线，而多肽样品的浓度则可根据标准曲线而确定。该测定方法可以不受变性溶液中的还原性物质干扰，反应十分迅速；其结合物在室温下1 h 内保持稳定，重复性好。

2.银染法　银染法检测聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质，是利用银离子在碱性环境下被还原成金属银，沉淀在蛋白质的表面上显色的原理。银染法种类很多，有文献报道的就有100 多种，但是其准确的染色机制还不是特别清楚。由于银染的灵敏度很高，检测极限低于1 ng，故广泛用在2D 凝胶分析上，以及极低蛋白质含量测定的垂直凝胶中。

（三）紫外分光光度法

紫外分光光度法是所有的蛋白质定量方法中检测速度最快的方法，常与化学法或染料结合法联用。通常在280 nm 波长处读数，其在280 nm 波长处的最大吸光度主要取决于酪氨酸和色氨酸。在238 nm 波长的吸光度也常用到，其在238 nm 波长处的最大吸光度与多肽中的肽键的数量成正比，所以此方法适用于多肽含量的测定。