基因工程技术中广泛应用的二级结构分析方法

（一）X-射线晶体衍射法

X-射线晶体衍射法是一种可以揭露分子大小、形状、对称性和聚集状态的可间接研究多肽晶体空间结构的方法。该方法由各种波长的X-射线通过晶体产生衍射线后形成复杂的衍射图谱，经过一系列数学处理，并参照化学分析的结果，进而确定晶体结构。虽说其精确度可靠，但是也有着多肽的晶体难以制成、测定周期较长等缺点。由于该方法只能提供多肽的静态结构，而生理状态下的多肽一般为液体，因此该方法无法测定一般生理状态时多肽的构象。

（二）核磁共振法

核磁共振是磁矩不为零的原子核在外磁场作用下自旋能级发生塞曼分裂，共振吸收某一频率的射频辐射的物理过程。二维、三维及四维核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）被用于定量分析混合物中各组分组成含量、氨基酸序列等。NMR 通常被用于相对分子质量相对较小的多肽结构的分析。该分析方法快速、准确，利用α螺旋、β折叠和无规结构的化学位移参考值的统计结果，核Overhauser 效应以及计算机图像系统或距离几何法搭出多肽的基本骨架和结构，再利用能量优化法或分子动力学方法对多肽结构进行进一步的修正。

（三）红外光谱法(www.xing528.com)

红外光谱是最早投入使用的研究多肽二级结构的方法之一。多肽的酰胺基团在红外区域有9个特征振动模式或基团频率（酰胺Ⅰ带、酰胺Ⅱ带、酰胺Ⅲ带、酰胺Ⅳ带、酰胺V带、酰胺Ⅵ带、酰胺Ⅷ带、酰胺A 带、酰胺B 带），一般选取酰胺Ⅰ带用于对多肽二级结构的分析。由于不同二级结构所对应的振动吸收峰严重重叠会形成宽峰，因此可结合二阶导数光谱对重叠峰进行分辨；其他常用分峰方法还有去卷积和曲线拟合，后两者还可获得定量信息。

（四）圆二色光谱法

圆二色光谱（简称CD）法，是应用最为广泛的测定多肽或蛋白质二级结构的方法，也是研究稀溶液中多肽或蛋白质构象的一种快速、简单、较准确的方法。当一束平面偏光通过介质时，光学活性物质分子对左、右圆偏振光的吸收不同，光学活性分子对左、右圆偏振光的吸收率差值称为圆二色性。不同波长的紫外光谱条件下，导致圆二色性的原因各不相同，当在250 nm 以下的远紫外光谱区，这主要取决于肽键。在远紫外光谱区段，α螺旋、β转角、无规结构等在特定波长下峰的正负和强弱都不同，因此根据所测得多肽的远紫外圆二色光谱，可以反映多肽的二级结构信息。