基因工程技术与重组多肽的开发应用-埃德曼降解法

（一）埃德曼降解法

埃德曼降解法（Edman degradation）亦称PTC 法或PTH 法，是蛋白质或多肽的氨基末端分析法之一，由埃德曼（Edman）于1950 年公布。埃德曼降解法通过一系列的化学反应来去除和识别多肽链末端的氨基酸残基，即带有游离α-氨基的残基。同时，序列中的下一个残基被制造出来，并经受同样一轮化学反应，重复这一过程可以揭示多肽的序列。这种方法使得测定多肽或全蛋白的延伸序列成为可能，并被广泛应用到今天。根据此原理设计的氨基酸自动序列仪（amino acid sequenator）于1967年制成，实现了蛋白质测序自动化，在对蛋白质一级结构的确定上发挥了巨大威力。

埃德曼降解法作为一种蛋白质测序方法，其优势在于样品不需要进行预处理，可识别确切的N-末端氨基酸，通过色谱法鉴定和定量释放的氨基酸，使混合物中蛋白质的N 端测序成为可能。但是其也存在一定的局限性，如：该方法通常不能用于确定二硫键的位置；较大的蛋白质或蛋白质N-末端经过化学修饰则无法使用该方法进行测序；如果遇到非α-氨基酸测序将停止等。

（二）2，4-二硝基氟苯法

2，4-二硝基氟苯法（DNFB 法）由获得两次诺贝尔奖的英国生物化学家Sanger于1945 年首先提出，用来鉴定多肽、蛋白质的N-末端氨基酸，该方法又称Sanger反应（桑格反应）。其主要原理是利用多肽的末端氨基与2，4-二硝基氟苯（DNFB）在弱碱性溶液中作用生成可耐酸性、100 ℃高温的二硝基苯基多肽（DNP-多肽）。水解时，肽链断开，但二硝基苯基并不脱落，形成二硝基苯基氨基酸（DNP-氨基酸）。二硝基苯基氨基酸可溶于有机溶剂，这样即可与其他氨基酸分开，通过高效液相色谱法可分离鉴定二硝基苯基氨基酸，确定多肽的N-末端氨基酸。

（三）丹磺酰氯法

丹磺酰氯法（DNS法）由Hartley等于1956年公布。丹磺酰氯是一种荧光物质，该方法主要原理是在碱性条件下，多肽的α-氨基能与丹磺酰氯反应，生成丹磺酰-多肽（DNS-多肽），经水解可生成丹磺酰-氨基酸（DNS-氨基酸）；通过电泳法或聚酰胺薄膜层析分析丹磺酰-氨基酸（DNS-氨基酸），可鉴定出多肽的N-末端氨基酸是何种氨基酸。此方法灵敏度高，也可用于蛋白质氨基酸组成的测定。(www.xing528.com)

（四）异硫氰酸苯酯法

异硫氰酸苯酯（PITC）在弱碱性条件下对多肽进行处理，PITC 与肽链的N-末端氨基酸残基反应，形成苯氨基硫甲酰-多肽（PTC-多肽）。然后用三氟乙酸处理PTC-多肽，使N-末端氨基酸残基肽键被有选择地切断，释放出该氨基酸残基的噻唑啉酮苯胺衍生物。接下来将衍生物用有机溶剂（如氯丁烷）从反应液中萃取出来，经酸作用形成苯乙内酰硫脲（PTH）衍生物，即PTH-氨基酸。将PTH-氨基酸利用滤膜过滤后用色谱法分析即可确定多肽的N-末端氨基酸。

（五）肼解法

肼解法是目前测定C-末端残基最重要的化学方法。该方法将多肽溶于无水肼中，在100 ℃进行反应，C-末端氨基酸即以游离氨基酸状态释放，而其余肽链部分与肼生成氨基酸肼，酰肼化物能够与苯甲醛缩合成不溶于水的物质而与C-末端氨基酸分离。这样C-末端氨基酸可以采用抽提或离子交换层析的方法将其分离出而进行鉴定分析。如果C-末端氨基酸侧链带有酰胺如天冬酰胺和谷氨酰胺，则肼解时不能产生游离的C-末端氨基酸。

（六）酶解法

氨肽酶或羧肽酶等肽链外切酶可以专一地从多肽链的N-末端或C-末端开始逐个降解，释放出游离的氨基酸。被释放的氨基酸数目与种类随反应时间的变化而变化。根据释放的氨基酸数量（摩尔数）与反应时间的关系，利用液相色谱-质谱联用（LC-MS）技术确定各肽段，便可以知道该肽链N-末端或C-末端氨基酸残基的排列序列。