多肽的分离与纯化技术

多肽制备得到的产物除多肽外，还常常含有部分未水解的蛋白质、氨基酸、蛋白酶和无机盐等，为了得到目标多肽，还需要进行更深层次的分离纯化。

近年来，伴随着生物技术和多肽结构鉴定等研究的不断深入，出现了很多新型高效的分离纯化方法，如膜分离（超滤、纳滤等）技术、层析技术、离子交换色谱技术、亲和层析技术和高效液相色谱法等。下面逐一进行简单介绍。

（一）膜分离技术

膜分离，是一种以滤膜为分离介质，借助膜的选择渗透作用和外界能量或化学位差的推动作用，利用不同孔径的膜对混合物料进行相对分子质量截留、筛分的物理分离过程。根据滤膜孔径和可截留物质相对分子质量大小的不同，膜分离技术可分为微滤、超滤、纳滤和反渗透滤等类型，超滤是膜分离法中最常用的方法。超滤膜的孔径在1 nm～0.05μm，一般可截留相对分子质量1000～500000的化合物。现在所研究的活性肽多由3～20 个氨基酸残基组成，远小于较大的蛋白质分子。因此，通过选用较大截留相对分子质量的超滤膜，先将大肽和未水解完全的蛋白质分子截留除去，接着，根据目标肽的相对分子质量区段，选用孔径合适的超滤膜进行下一步分离提纯。纳滤是分离性能介于反渗透和超滤之间的一种分离方式，纳滤膜具有纳米级孔径，一般在1～10 nm，截留相对分子质量为80～1000。很多纳滤膜的截留相对分子质量足够小，能分离多肽与无机盐和水，可实现脱盐与浓缩同步进行。

膜过滤可在常温下进行，且过滤过程中不进行化学反应。目前，多种类型膜分离技术在生产中协同联用，取长补短。相比色谱技术，膜过滤更适合进行物质的大量分离。

（二）层析技术

1.疏水作用色谱　疏水作用色谱（hydrophobic interaction chromatography，HIC）是利用多肽中含有的疏水基团与固定相之间产生疏水作用而达到分离分析的目的。Geng等利用HIC柱将大肠杆菌表达出的经盐酸胍乙啶变性得到人重组干扰素-γ。通过HIC 柱可纯化、折叠出高生物活性的产品。

2.分子排阻色谱　分子排阻色谱，又称尺寸排阻色谱（size exclusion chromatography，SEC），利用多肽分子大小、形状差异来分离纯化多肽物质，特别对一些较大的聚集态的分子更为方便，如生长激素（GH）的分离。不同结构、构型的GH在SEC 柱上的分离行为完全不同，从而可分离不同构型或在氨基酸序列上有微小差异的变异体。

（三）离子交换色谱技术

离子交换色谱（ion exchange chromatography，IEXC）技术可在中性条件下利用多肽的带电性不同而分离纯化具有生物活性的多肽。离子交换色谱柱可分为阳离子柱与阴离子柱两大类，色谱柱填料可以是一些新型树脂，如大孔型树脂、均孔型树脂、离子交换纤维素、葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶树脂等。在多肽类物质的分离分析研究中，对多肽的性质、洗脱剂、洗脱条件的研究较多，不同的多肽分离条件有所不同，特别是洗脱剂的离子强度、盐浓度等对纯化影响较大。Wu 等报道利用离子交换柱层析法，探讨分离牛碳酸酐异构体和牛血清白蛋白酶、鸡血清白蛋白酶的提取条件，获得了有价值的数据，为今后此类物质的分离研究提供了参考。

（四）亲和层析技术(www.xing528.com)

亲和层析（affinity chromatography，AC）技术是利用连接在固定相基质上的配基与可以和其特异性产生作用的配体之间的特异亲和性而分离物质的层析方法。自1968 年Cuatrecasas 提出亲和层析概念以来，人们在寻找特异亲和作用物质时发现了许多组合，如抗原-抗体、酶-催化底物、凝集素-多糖、寡核苷酸与其互补链等。在多肽类物质分离中，目前主要应用其单抗或生物模拟配基与其亲和，这些配基有天然的，也有根据其结构人工合成的。Patel 等利用一系列亲和柱分离纯化得到了组织型纤溶酶原激活物蛋白多肽。

固定金属亲和层析（immobilized metal affinity chromatography，IMAC）技术是近年来发展起来的一种亲和方法。其固定相基质上螯合了一些金属离子，如Cu2+、Ni2+、Fe3+等，可通过配位键螯合侧链含有Lys、Met、Asp、Arg、Tyr、Glu和His 标签的多肽，肽序列中含有His-X-X-X-His 结构的多肽最易结合到金属离子亲和柱上，纯化效果较好。胰岛素样生长因子（insulin-like growth factor，IGF）、二氢叶酸还原酶融合蛋白等均可用此方法分离到纯度较高的产品。

Chaiken 等报道了另一种亲和层析方法，利用反义DNA 表达产生的多肽或蛋白质与正链DNA 表达产生的多肽或蛋白质具有一定的亲和性，例如，精氨酸（Arg）加压素受体复合物已可用此法分离得到。DNA与蛋白质、多肽复合物之间的作用也常用于生物亲和层析。将人工合成的寡核苷酸结合在固定相基质上，使样品蛋白或多肽从柱中流过，与之结合，从而达到分离特定结构多肽的目的。

（五）高效液相色谱法

高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）有分离效果好、检测灵敏度高、分离纯化速度快等优点，相对于其他分离方法具有更高的准确度和优越性，较适合于分离纯化高纯度的多肽产品。在分离纯化蛋白质和多肽的过程中最常用到的是反相高效液相色谱法，其根据待分离的组分在固定液中分配性能的不同实现分离。该方法适用于分离纯化分子质量在5 kDa 以下的组分，尤其是分子质量低于1 kDa 的小分子肽类物质。

虽然分离纯化的方法繁多，但由于大多数多肽具有相似性，使用目前的方法已经达不到理想的分离效果，而且都或多或少存在一定的弊端。近年来，国内外学者对多肽的分离纯化研究提出很多新思路和尝试，新的多肽分离纯化方法或将朝着以下几个方面发展。

（1）收集多肽图谱，组建多肽分离纯化方法数据库，制作多肽分离纯化的预测软件，这有利于多肽的分离纯化和对比分析。

（2）选用载体，先将目标多肽与载体结合转化为易分离的物质，待分离出目标多肽后，再去掉载体，获得多肽纯品。

（3）多种方法联用技术。近年来，采用多种方法联用技术分离纯化多肽已取得一定进展，联用技术显示出巨大的优越性。