基因工程技术：重组活性肽制备

以上简述了酶水解法、微生物发酵法、化学合成法、分离提取法制备活性肽的方法，这些方法各有其优势和在应用上的局限性。

将基因工程技术应用于活性肽的开发方面，可以产生“神奇”效果。该法使得某些通过天然方法难以获得或产量低下的活性肽的生产成为可能，可降低天然方法获取多肽的昂贵成本，并且安全性高。利用DNA 重组技术将一些起重要作用的蛋白质（如各种细胞生长因子）在真核及原核细胞中高效表达，得到特定的蛋白质或多肽产品，使得适量补充某些外源性蛋白质成为可能。在化妆品工业方面，利用基因工程技术、发酵技术及蛋白纯化技术按人们的意愿生产出的具有特定用途的活性肽有保湿、抗皱、紧致肌肤、美白淡斑、抗炎抗敏、防止光老化等强大的护肤效果，在美容护肤市场上已经备受关注。

下面将详细介绍如何利用基因工程技术制备重组活性肽。

重组活性肽（recombinant active peptide）指利用基因工程技术得到的与人体内活性肽具有相似功能的活性片段，是对生物机体的生命活动有益或具有生理作用的肽类化合物，是约20 种天然氨基酸以不同组成和排列方式构成的从二肽到复杂的线性、环形结构的不同肽类的总称，也是源于蛋白质的多功能化合物。

运用基因工程技术制备多肽，即利用DNA 重组技术将待合成的目标肽的遗传密码（基因）在体外进行切割和适当的载体拼接、重新组合，获得重组DNA 分子，然后采用特定方法导入宿主细胞基因组中，通过细胞表达获得所需要的活性肽；或将外源基因插入噬菌体基因序列中，使得目标肽以整合蛋白形式表达噬菌体颗粒并经加工和纯化后获得（图1-3）。与化学合成法相比，基因重组法更适于长肽的制备。

图1-3　重组多肽的制备流程

DNA 重组技术合成多肽的一般流程：载体的选择→目的基因的制备→体外DNA 的重组（酶切与连接）→重组DNA 分子引入受体细胞→转化子的筛选→重组DNA 分子的鉴定。

载体的作用是把外源DNA 带进宿主细胞，并使之在细胞内建立稳定的遗传状态，在细胞内繁殖、传代或进行表达。质粒载体是最常见的载体，也是使用最方便的载体。常见的质粒载体有pBR322、pUC18/19、pUC118/119、pGEM-3Z/4Z以及一些多功能的质粒载体，如pBluescript Ⅱ KS（±）。大肠杆菌表达载体是最常见的原核表达载体，可分为融合蛋白表达载体和非融合蛋白表达载体。常用的标签蛋白有谷胱甘肽转移酶、六聚组氨酸肽、蛋白质A 等。

重组DNA 所涉及的工具酶，最主要的是Ⅱ型限制性内切酶和DNA 连接酶。

Ⅱ型限制性内切酶用来切割DNA，相当于基因工程中的“剪刀”。Ⅱ型限制性内切酶识别回文序列，在回文序列内部或附近切割DNA，产生带3'-羟基和5'-磷酸基团的DNA 产物，需要Mg2+ 的存在才能发挥活性；识别序列主要为4～6 bp，或更长且呈二重对称的特殊序列，但有少数酶识别更长的序列或简并序列，切割位置因酶而异。如EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ的识别序列和切割位置如下：(www.xing528.com)

DNA 连接酶则是将两段核酸连接起来的酶，相当于基因工程中的“糨糊”。常用的T4 DNA 连接酶是在T4 噬菌体感染的大肠杆菌中发现和分离的，需要Mg2+和ATP的存在才能发挥活性。它能催化两条匹配DNA链的3'-羟基和5'-磷酸基团之间形成磷酸二酯键而把两个DNA 分子连接在一起。

外源DNA 就是需要克隆的基因片段，一般有四种来源：①限制性内切酶切割DNA 产生的片段，经电泳分离后回收获得；②大DNA 分子经人工剪切产生的片段，这种片段一般是平末端；③cDNA，即与mRNA 互补的DNA，由真核基因的mRNA 逆转录制备；④人工合成的基因，如根据蛋白质的氨基酸顺序和遗传密码合成的一些基因。

外源DNA 分子与载体（质粒）经过相同的酶切可以产生相互匹配的黏末端或平末端，经DNA 连接酶连接就构成了重组DNA 分子（重组质粒）。质粒的转化就是指将质粒或以它为载体构建的重组DNA分子导入细菌（受体细胞）的过程。这一步是实现重组克隆的增殖。

受体细胞要接纳外源DNA，必须处于感受态。所谓感受态，就是细菌具有吸收周围环境中的DNA 的生理状态。为了提高受体细菌摄取外源DNA 的能力，提高转化效率以获得更多的转化子，人们摸索出了不同的方法处理细菌，使其处于感受态。目前主要采用电转化法和CaCl2 法将外源DNA 导入受体细胞中，并需要相应地制备电转化感受态细胞和CaCl2 感受态细胞。

接纳外源DNA 后获得了新的遗传标记的细菌细胞或受体细胞被称为转化子。获得转化子后可以采用多种方法筛选和鉴定目的克隆。首先可根据转化细胞的特征进行初步筛选。由于载体都具有供筛选用的遗传标记，例如抗生素，细胞转化后获得了这种遗传特性，使用含适当的相应抗生素的培养基即可初步筛选出转化的细菌。经过培养并初步筛选出来的细菌不一定都含有重组DNA，还需进一步对DNA 进行分析鉴定，常用方法一是进行重组质粒的抽提，然后电泳分析，观察其相对分子质量与原有载体相比是否增大；方法二是将抽提的重组质粒进行限制性内切酶分析，观察酶切下来得到的DNA 片段大小是否与预计的相符；方法三是以重组质粒为模板进行PCR 鉴定，观察PCR 产物的大小是否与目的基因大小相符；方法四则是将重组质粒进行DNA 序列分析，直接分析重组质粒上的插入片段即目的基因的大小与序列是否正确。

在确证得到核酸序列一致的基因后，接下来就要想办法使该基因得到表达，获得基因表达产物——蛋白质（多肽）。通常采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）对蛋白质进行量化、比较及特性鉴定。SDS-PAGE 不但能观察到蛋白质在电场中的泳动位置，还能知道蛋白质的相对分子质量大小以及由几个亚基组成。此外，还可将电泳胶上的蛋白质条带转移到尼龙膜上，以亲和反应或免疫反应来检测特异蛋白的存在，即所谓的免疫印迹法（Western blotting）。

在基因表达产物也得到确证之后，就可以对表达的蛋白质（多肽）进行发酵和分离纯化，并研究其生物学功能（图1-4）。

图1-4　重组多肽的研发流程