化学合成法：液相与固相合成的优点与应用

化学合成法主要是以氨基酸与氨基酸之间缩合的形式来进行，可简单理解为一个按顺序连接氨基酸的过程，此方法要求事先知道目标多肽的氨基酸序列。化学合成法一般多用于合成短肽和实验室研究，可分为液相合成法和固相合成法。

（一）液相合成法

液相合成法是经典的合成方法，因为在液体中进行，故称为液相合成法，有逐步合成和片段组合两种策略。逐步合成是由起始的氨基酸（肽）开始，每连接一次就延长一个氨基酸，方法简洁迅速，可用于各种生物活性多肽片段的合成。片段组合则是用N 保护肽同C 保护肽缩合来得到两者长度相加的新的长肽链，主要包括天然化学连接和施陶丁格连接（Staudinger ligation）方法。天然化学连接是多肽分段合成的基础方法，局限在于所合成的多肽必须含半光氨酸（Cys）残基，因而限定了天然化学连接方法的应用范围。天然化学连接方法的延伸包括化学区域选择连接、可除去辅助基连接、光敏感辅助基连接。施陶丁格连接方法是另一种基础的片段连接方法，其为多肽片段连接途径开拓了思路。正交化学连接方法是施陶丁格连接方法的延伸，通过简化膦硫酯辅助基来提高片段间的缩合率。

近年来，多肽液相片段合成法发展迅速，在多肽和蛋白质合成领域已取得了重大突破。对于由较少氨基酸组成的短肽，采用液相片段合成法速度快、纯度高，且能大量合成。

（二）固相合成法

自1963 年Merrifield 成功发明了多肽固相合成法以来，经过不断的改进和完善，如今，固相合成法已经成为多肽和蛋白质工程中的一项重要和常用的技术，有经典液相合成法无法比拟的优点。多肽固相合成的原理是把要合成的多肽中一端的氨基酸羧基、氨基或侧链基通过共价键与固体载体连接，然后从氨基端或羧基端逐步增长肽链，达到理想的合成肽链长度，最后将肽链从树脂上裂解下来，进行分离纯化获得目标多肽。与液相合成法相比，固相合成法具有操作简单、能够实现自动化操作的优点。

固相合成法通常应用Boc 多肽合成法和Fmoc 多肽合成法策略。(www.xing528.com)

Boc 多肽合成法是经典的多肽固相合成法，以Boc 作为氨基酸α-氨基的保护基，苄醇类作为侧链保护基，Boc 的脱除通常采用三氟乙酸（TFA）进行。多肽合成时将已用Boc 保护好的N-α-氨基酸共价交联到树脂上，TFA 切除Boc 保护基，N 端用弱碱中和。肽链的延长通过二环己基碳二亚胺（DCC）活化、偶联进行，最终采用强酸氢氟酸（HF）或三氟甲磺酸将合成的目标多肽从树脂上解离。Boc 多肽合成法的缺点在于，为了便于下一步的多肽合成，需反复用酸进行脱保护，导致一些副反应被带入试验中，如多肽容易从树脂上切除下来，氨基酸侧链在酸性条件不稳定等。

Fmoc 多肽合成法是Carpino 和Han 等以Boc 多肽合成法为基础发展起来的一种多肽固相合成的新方法。利用Fmoc 作为氨基酸α-氨基的保护基，侧链可用易于酸脱除的Boc 保护基进行保护。应用温和的碱处理可脱保护，肽段的最后切除可采用TFA/DCM（二氯甲烷）从树脂上定量完成，避免了采用强酸。与Boc 多肽合成法相比，Fmoc 多肽合成法反应条件温和，副反应少，产率高，并且Fmoc 基团本身具有特征性紫外线吸收波长，易于监测和控制反应的进行。这使得Fmoc多肽合成法在多肽固相合成领域的应用范围越来越广。

（三）其他化学合成法

1.氨基酸的羧内酸酐（NCA）法　氨基酸的羧内酸酐的氨基保护基也可活化羧基。NCA 法的原理：在碱性条件下，氨基酸阴离子与NCA 形成一个更稳定的氨基甲酸酯类离子，在酸化时该离子失去二氧化碳，生成二肽；生成的二肽又与其他的NCA 结合，反复进行。NCA 法适用于短链肽片段的多肽合成，其周期短、操作简单、成本低、得到的产物相对分子质量高，在目前多肽合成方法中所占比例较大，技术也较为通用。

2.组合化学法　20 世纪80 年代，研究者以固相多肽合成为基础提出了组合化学法，即通过组合的方式将氨基酸的构建单元连接起来，合成出含有大量化合物的化学库，并从中筛选出具有某种理化性质或药理活性的化合物。组合化学法的多肽合成策略主要包括混合-均分法、迭代法、光控定位组合库法、茶叶袋法等。组合化学法的最大优点在于可同时合成多种化合物，并且能最大限度地筛选各种新化合物及其异构体。

3.酶合成法　酶合成法是指用蛋白酶催化合成多肽。在活性肽的酶合成法中，最广泛应用的酶是丝氨酸和半胱氨酸内切酶。酶合成法与其他化学合成法相比，具有在温和条件下进行、专一性强、区域选择性广、毒性小、无消旋作用等特点。酶法多肽合成具有其不可替代的优势，但反应周期长、生产效率低等缺点使得依靠酶合成法进行多肽合成还远不能满足工业生产的需要，在实际生产中酶合成法的应用仍然有限。