前列腺癌中微小RNA检测结果-非编码RNA与肿瘤

检测微小RNA在不同组织中的表达，说明其具有较高表达量并且比mRNA更有预测性。在一定程度上可以根据微小RNA的表达，对于来源不明的低分化肿瘤进行分类，起到重要作用。然而寻找较为明确的前列腺癌微小RNA指标仍然有待解决。

目前，在报道上存在不同的观点，其产生的原因主要是，由于实验设计中低估患者的治疗，收集样本的方法，受损细胞的存在，试验平台的敏感性及特异性的不同导致。而一些微小RNA却在一些不同的前列腺癌肿瘤的实验中出现相反的表达，则说明肿瘤的研究结果仍然存在争议。事实上，一些研究表明微小RNA在肿瘤中广泛下调，这与微小RNA在肿瘤的终末分化以及肿瘤的退行性改变的趋势相一致。另一些研究例如Volinia则发现与肿瘤相关的微小RNA明显高表达。通过对比由363个实性肿瘤和177个正常组织中抽提的总RNA，证实在肿瘤中微小RNA明显上调。特别是在前列腺癌中，39个微小RNA上调，6个下调，这结果和之前的实验结果部分吻合，通过对60个前列腺癌的病理标本及16个癌旁组织进行显微切割并进行分析。两个实验都发现了一些上调的基因，如miR-32、miR-26a、miR-196a、miR-181a、miR-25、miR-93、miR-92、let-7i以及下调的基因miR-218、miR-128。而且Ambs也鉴定一些与前列腺癌的局部扩散有关的微小RNA，包括miR-101、miR-30c和miR-195，这些也和Volinia的实验结果相同。这些在前列腺癌中高表达的微小RNA也通过计算研究，对比三个不同的基因表达数据，证实了一些微小RNA在前列腺癌中的靶基因。

而其他研究小组却发现不同的结果。Porkka研究发现：根据6种前列腺癌细胞系、9种前列腺癌移植物以及13个临床前列腺组织；特别是4个前列腺增生、5个未治疗的前列腺癌和4个雄激素非依赖性前列腺癌初步分析发现，前列腺癌细胞系和肿瘤移植物的微小RNA的表达与雄激素受体的状态有关。另外微小RNA的水平与aCGH数据库中报道的微小RNA的趋势明显相关。对比前列腺癌与前列腺增生临床标本后发现异常表达的微小RNA，其中37个下调，14个上调。下调中有15个，上调中有6个，只发生在雄激素非依赖的肿瘤中。而Pokka与Ambs的结果不同：只有miR-184和198上调let-7i与Volinia相同，miR-205、221下调与Ambs相同。Ozen在近期研究中发现对比16个前列腺癌组织和10个正常前列腺组织发现微小RNA在前列腺癌中广泛下调，检测的85个微小RNA中76个下调。而早期生化复发中发生变化的微小RNA则更多。综上所述，Porkka和Ozen，确定几个微小RNA明显下调包括let7家族、miR-16、miR-23a/b、miR-99、miR-125a/b、miR-29a/b、miR-30a/b/c。

近来Tong分析了40个福尔马林固定石蜡包埋的前列腺穿刺标本，都是处于T2a/b阶段的肿瘤，其中包括20个术后2年生化复发的和20个在术后10年后无复发的标本。对于每个标本，恶性区域进行显微切割后与正常组织进行比较研究。发现其中miR-23b、miR-100、miR-145、miR-221、miR-222下调，早期复发的肿瘤则表现更为明显。

基于上述的不同结论，现在很难得出一个可以在前列腺癌中使用的微小RNA指标。揭示芯片技术为我们提供了一个可以建立与病人相关的治疗工具，但是由于微小RNA芯片的高通量以及微小RNA的研究处于早期，对于其结果仍然需要谨慎揭示。这些研究结果的成功应用，需要有实验室、病理分析以及生物信息学专家的密切合作，因为其生物系统的复杂性提示实验室内外都有可能存在各种变化。

首先，技术路线缺乏会影响实验结果。使用总RNA提取和小RNA富集技术会导致敏感性不同，因此检测微小RNA和微小RNA的降解都会发生变化。设计的用来检测成熟和不成熟的微小RNA的探针也会由于设计过程的改变而歪曲检测结果。

其次，实验中的取材质量极为重要。组织的处理和选择将会对芯片数据产生根本性的影响。虽然我们知道微小RNA相对于mRNA稳定，但是不同的试验方法和组织冻存时间也会导致微小RNA的不同表达。考虑到以上因素，已经有证据表明缺氧会导致微小RNA的表达发生变化。特别是在体积较大的实体肿瘤中这种现象发生较多。这种情况下会进一步发生组织的不均一性。在肿瘤标本中，组织不均一性多由于遗传的不稳定性，会出现其他类型的细胞不同程度的污染，例如成纤维细胞、肌细胞、内皮细胞和炎症细胞等。另外在肿瘤的早期病灶中，周围会有正常组织细胞的围绕。另一方面，小心选择正常的组织很关键，同样会被肿瘤细胞污染，而且也会反映一些异型增生的微小RNA。因此，激光显微切割是解决这一问题的主要方案。

第三，实验设计和病例的选择会导致结果发生改变，不仅由于肿瘤的分级和评分出现影响，而且会存在放疗与否或者去雄治疗都会对微小RNA的表达产生影响。

肿瘤的发生和发展由于基因突变不断积累，导致位于扩增区和减少区域的基因发生改变，被称为癌基因或者抑癌基因。同样这一论点也适用于微小RNA，并且发现在肿瘤的进展过程中，微小RNA处于肿瘤相关的基因区域。

染色体对比基因杂交和杂合体丢失研究证实，在早期的肿瘤基因缺失特别是在6q、8p、10q、13q、16q和17p通常会出现改变。在雄激素非依赖的前列腺癌中LOH经常升高3～4倍，染色体改变常见。在7p、7q、8q和Xq出现扩增与其进展密切相关。在8q区域出现扩增较为常见，而晚期前列腺癌则主要发生在整个8q区域。虽然可能多个基因在此区域发生改变，但是c-Myc发生在8q24的扩增被认为是与前列腺癌进展有关。在杂合子缺失方面没有发现主要目的基因。虽在13q存在两个重要的肿瘤抑制基因BRCA2和RB1，但是两个基因下调并没有发现和LOH相关。通过对13q染色体伴随体的研究发现在13q14.2- q14.3有大约800kb的缺失。这些基因失衡在大约65%的前列腺癌中发现，并且与早期的生化复发有关。

1. miR-15a/16

在上述介绍的区域中包括有两个微小RNA基因即miR-15a和miR-16，在慢性淋巴性白血病中出现缺失或下调，并通过转录后抑制抗凋亡基因BCL2诱导凋亡。

基于上述假设发现这些微小RNA早期并没有被认为是前列腺癌中的肿瘤抑制基因。通过qRT-PCR分析将20个前列腺癌与其正常组织进行对照，并利用原位杂交分析15个前列腺肿瘤穿刺标本发现癌miR-15a、miR-16在绝大多数肿瘤中下调。通过利用两个前列腺细胞系发现正常的RWPE1细胞和前列腺癌LNCaP细胞系对比发现同样减少。并且对其功能及作用靶基因进行了研究。一个利用慢病毒介导的两个微小RNA基因下调的REPE细胞，诱导了再生和迁移能力的增强，并在NOD/SCID鼠身上形成肿瘤。相反在LNCaP细胞中利用慢病毒高表达微小RNA后，使得肿瘤细胞出现凋亡并使得肿瘤移植物缩小。另外在正常的BALB/C小鼠身上注射抗miR-15、miR-16后导致该部位畸形生长并出现腺泡改变。这个发现部分揭示了miR-15、miR-16能够在转录后途径抑制BCL2、CCND1和WNT3A表达，并干扰多个癌基因的活动。BCL2被认为明显上调，特别是在雄激素非依赖的前列腺癌使得细胞在去雄环境中生长。CCND1是细胞再生的重要启动子，并更多受到miR-15、miR-16的调节。

WNT3A在前列腺癌的进程中发挥作用，通过提高连环蛋白稳定性及其转录过程，同时激活其中轴途径的癌基因途径，例如AKT和MAPK。β连环蛋白的稳定会导致几个癌基因的转录增强，例如CCND1、MYC、MMPs。雄激素受体作为共同激活因子，在低雄激素环境下提高活力，AKT和MAPK的激活同样促进前列腺癌细胞在去雄环境下的再生与生长。另外，近来的报道认为miR-15a/16调节VEGF的水平，提示这两种微小RNA控制血管生成活动。总之，几组证据证明miR-15a/16的缺失会通过几种途径促进前列腺癌的进展。

2. miR-101

miR-101作为另一个微小RNA其基因缺失被认为是一种异常的调节。miR-101位于1号染色体和9号染色体，发现在局限性前列腺癌病例中缺失37.5%，而在转移性前列腺癌中有66.7%缺失。另外根据公共CHG数据，在多个肿瘤中出现上述情况。miR-101在DU145前列腺癌细胞系中高表达，并促进细胞凋亡，而在体内减少其侵袭力。miR-101在前列腺癌的进展过程中，其下调伴随着EZH2的增高，证实其作为miR-101的靶基因。EZH2的主要功能是调节细胞活动，抑制histone、lysine27，导致基因沉默。EZH2被描述为在许多实性肿瘤中高表达，起到促进细胞再生、不依赖支持物生长以及促进侵袭的作用。虽然其机制仍不明朗，但是miR-101的发现可能是其主要的分子途径，并影响细胞胚胎学发展。

3. miR-449

同样的miR-449通过调节HDAC1水平来影响细胞的转录水平。HDAC通过改变组氨酸的乙酰基位点，阻止细胞转录，进而提高染色体凝集。在实验中则在肿瘤中高表达并改变HDAC抑制子的作用。HDAC在70%的前列腺癌高表达。并在前列腺癌动物模型中发挥作用。miR-449的水平发现在前列腺癌中降低，而转入PC3细胞中则会导致生长抑制，凋亡，衰老样改变。因此假设由于前列腺癌缺乏5q12区域的易感性，导致miR-449低表达，并进一步上调HDAC1，影响下游基因沉默。(www.xing528.com)

4. miR-34

微小RNA不但可以通过改变上游基因的转录水平影响基因进程，而且也可以作用于下游转录因子调节其功能。几个研究表明，miR-34家族参与p53肿瘤抑制系统的作用。miR-34的表达通过P53途径进行DNA损害以及基因沉默。miR-34的活化会参与p53的作用，通过下调CDK4、CDK6、Cyclin D1、Cyclin E2、E2F3和BCL2蛋白水平，抑制细胞周期，使其凋亡。另一方面，敲除miR-34会影响p53介导的细胞凋亡。在前列腺癌中miR-34在雄激素非依赖过程中缺失，而p53在PC3和DU145细胞中缺乏。miR-34在PC3细胞中会影响细胞生长，减少抗药性。有趣的是，miR-34也会抑制SIRT1，该基因会阻碍p53介导的细胞凋亡和增加缺氧等条件下的存活能力。在多种细胞中高表达包括PC3和DU145，它们会出现药物抵抗性。因此miR-34参与一个正性的通路，通过抑制SIRT1来提高p53的活性。其缺失也就是p53的缺失。

5. miR-23

通过对谷氨酞胺的作用，miR-23通过MYC的高表达参与促肿瘤生成过程。并被认为是前列腺癌中重要的变化。其上调会增加氧的消耗，并且增加线粒体的聚集作用。肿瘤细胞依赖线粒体参与细胞代谢，包括谷氨酞胺。谷氨酞胺是细胞能量的主要来源，它的分解会为组织代谢提供所需的氮和碳类物质。另一方面谷氨酞胺的分解为谷胧甘肤的合成提供底物，从而保护细胞免于氧化作用。MYC高表达会提高线粒体谷氨酞胺酶的作用，使谷氨酞胺转化为谷胧甘肤。这一影响通过MYC诱导的miR-23抑制作用发挥作用。根据Porkka的分析，miR-23在前列腺癌中低表达，从而提高MYC相平行的谷氨酞胺酶的水平。因此miR-23在肿瘤细胞中的低表达连接了从基因水平到细胞的代谢异常。

6. miR-146

对比雄激素依赖性前列腺癌细胞系，miR-146在雄激素非依赖性前列腺癌细胞系中明显下调。同样通过荧光原位杂交技术在人的前列腺癌标本中得到证实。miR-146在前列腺癌的进展中抑制ROCK1的表达。它是透明质酸介导的下游影响因子，并通过CD168受体发挥作用。透明质酸由间质成纤维细胞合成，并通过肿瘤细胞旁分泌作用产生的因子发生反应，并且对于雄激素非依赖前列腺癌的产生和进展尤为重要。尤其是肿瘤细胞对于宿主细胞层的黏附作用以及继发的肿瘤侵袭作用对于肿瘤的浸润和转移起到关键作用。ROCK1介导的促癌机制，包括肌球蛋白轻链的磷酸化，会导致细胞转移和侵袭能力增加，激活AKT/TOR/EIF4E信号通路，增加M-CSF的产物从而利于其溶骨性的转移。有趣的是：已经被证实miR-146抑制受体CXCR4的翻译，在此途径中PLZF因子抑制miR-146的转录，因此激活CXCR4的翻译。虽然有报道说可能有不同的途径，但是却与其转移密切相关。事实上，在胚胎时期骨髓造血细胞的发育过程中，SDF1及其受体CXCR4在其进程中起到了关键作用。在其他不同的肿瘤类型中，包括骨转移的前列腺癌以及乳腺癌，显示出CXCR4在转录后阶段过表达。而在前列腺癌中CXCR4明显高表达，并且与其预后不佳有关。因此miR-146的下调，会提高前列腺癌的进展，且通过多个有可能转移前蛋白包括ROCK1和CXCR4而发挥作用。

7. miR-205

就像前面描述的关于转移的研究，miR-205在前列腺癌细胞系中，23个前列腺癌标本中下调。在DU145中，miR-205明显上调后会导致形态改变出现上皮向间质转换。miR-205转染的细胞会转变成纤维样生长类型，转化成为大且扁平多角形的细胞并集落样生长的细胞。这些细胞会增加其黏附能力，其中E-cadherin和β-catenin明显升高，并在细胞间联系作用上调。在上皮向基质细胞转化中，作为转移前标志物的miR-205再次转染会导致DU145和PC3转移和侵袭能力明显降低。这一作用通过miR-205对目的基因PRKCE和ZEB2 mRNA发挥作用。而在前列腺癌的进展过程中，则是通过ZEB2介导的抑制上皮细胞黏连蛋白转录的抑制发挥作用，并通过PKC诱导的增加细胞再生抑制凋亡以及促进细胞的雄激素非依赖性。PKC则比ZEB2更容易产生像miR-205细胞的表型。有趣的是DU145转染了miR-205后通过基因表达分析发现会诱导多个基因参与到细胞的链接，并下调几个促进肿瘤发生的基因，其中的一些已经和前列腺癌的进展有关，包括IL6、E2H2、ERBB3、E2F1、E2F5。

8. miR-21

虽然在前列腺癌中miR-21并没有进行深入的研究。但是在众多肿瘤的研究中均发现其明显上调。因此miR-21是一种肿瘤的标志物。在前列腺癌非依赖细胞系中，PC3、DU145升高。通过转染miR-21抑制物下调并不会影响细胞再生，但是会增加化疗药物诱导的凋亡，增加细胞的活动性及浸润性。MARCKS被鉴定为miR-21在前列腺癌中的新目标。它会参与细胞的多个进程，包括细胞黏附扩散细胞的活动性，并通过改变其水平发挥作用。然而在其他的肿瘤中发现，miR-21高表达的细胞会改变很多基因的水平。目前已发现的相关靶基因主要包括PDCD4、PTEN、TPM1、SPRY2、TIMP3和RECK。

9. miR-221/222

miR-221是在肿瘤中高表达的微小RNA。有报道表明miR-221在多个肿瘤中高表达。在前列腺癌细胞系中，miR-221与细胞周期抑制剂p27负相关。通过转染miR-221至低表达LNCaP的细胞中会增加细胞增长的潜力，其主要是通过诱导细胞周期G1-S期转换，提高其软琼脂克隆形成以及SCID鼠上的成瘤性。相反的，通过抑制miR-221在PC3细胞系的表达可以抑制其在体外克隆形成以及减少体内肿瘤的生成。P27和P57是其靶基因从而改变肿瘤的生长，其中P27在多个肿瘤中作为检测预后不良的标记物。进一步研究发现其在雄激素非依赖过程中也会发挥作用。有研究表明在雄激素非依赖的前列腺癌细胞系中miR-221高表达。过表达miR-221在雄激素依赖的LNCaP细胞中明显减少，对于DHT刺激的PSA的升高促进其去雄的生长。相反的减少miR-221在AIPC细胞的表达会较少细胞的生长并且恢复其对于DHT的敏感。因此增加的miR-221水平会促进雄激素非依赖性生长，保持其雄激素非依赖的表型。发现与雄激素下调miR-221的水平，会帮助解释在某些微小RNA芯片研究中的不同水平。在早期雄激素依赖性疾病中，雄激素通过保持miR-221的低水平起到保护作用。丢失了其保护则会促进前列腺癌的进展。

10. miR-125b

miR-125b是在研究与前列腺癌进展以及雄激素非依赖过程中发挥作用的微小RNA，它被认为受到雄激素的作用上调并且在雄激素非依赖的LNCaP细胞亚系中明显高表达。这些有争论的发现说明，miR-125b在雄激素非依赖的调节中的作用仍然存在。与miR-221/222相似转染合成的miR-125b会刺激细胞在去雄环境中生长，然而抑制miR-125b则会减少雄激素非依赖细胞的生长。在研究中发现，凋亡基因Bak1是miR-125b的靶基因。Bak1被认为是前列腺癌进展中的相关基因，并且在雄激素抵抗的前列腺癌中低表达。然而干扰Bak1并不会增加前列腺癌细胞的生长，因此需要进一步研究其作用机制。总之，miR-125b作为致癌基因在前列腺癌中的作用需要进一步的研究，就像三个在前列腺癌中低表达微小RNA的一样。miR-125b在乳腺癌中作为一种肿瘤抑制基因，负调控ERBB2（HER2）和ERBB3（HER3）的表达。虽然微小RNA可以在不同的肿瘤细胞中发挥不同的致癌或抑癌作用，但是令人疑惑的是，在前列腺癌中上调HER2被认为与其雄激素非依赖进程相关。

11. miR-32，miR-106B-25-93，miR-126

miR-32、miR-106B-25-93、miR-126分别位于C9orf5和MCM7的基因内部。这些微小RNA在前列腺癌中由于其前体的高表达而在前列腺癌中上调。但C9orf5在肿瘤中的作用仍不明了，MCM7的扩增被认为与前列腺癌相关。然而它们之间的功能相关性仍然不明了，是否其扩增导致致癌作用与前体基因或者miRs相关。miR-32被认为会抑制Bim的表达，Bim是BCL2家族的凋亡前体因子，其下调会抑制肿瘤细胞凋亡。miR-106b起到抗凋亡作用，生长抑制活性，并通过抑制E2F1和p21/WAF1发挥作用。E2F1同样是miR-17-5P和miR-20a的靶基因。两者都属于miR-17-92簇，并在多个肿瘤中上调，其中包括前列腺癌。矛盾的是miR-126由于其宿主基因EGF样区域低表达，在前列腺癌细胞中不表达。而其缺乏导致其靶蛋白一种前列腺特异性抗原上调，并减少LNCaP细胞的转移和侵袭。