海岸带生物活性物质：蛋白、肽及氨基酸成果

一、海岸带藻类活性蛋白

藻类广泛分布于各种地球环境中，特殊的生长环境赋予了藻类特殊的生物活性物质，目前国内外学者已在藻类中发现了抗病毒、抗肿瘤、抗炎症、抗菌、免疫调节、降血糖、降血脂等蛋白、肽及氨基酸类活性物质（唐志红等，2006）。

（一）藻胆蛋白

藻胆蛋白（phycobiliprotein）是由Esenbeck于1836年首次发现的，并于1943年被Kuiring正式命名。藻胆蛋白是存在于蓝藻（Cyanophyceae）、红藻（Rhodophyceae）、隐藻（Cryptophyceae）和少数一些甲藻（Pyrrophyceae）中的捕光色素蛋白，能把捕获的光能高效地传递给光系统反应中心，用于光合作用。在蓝藻和红藻中，不同的藻胆蛋白，包括藻红蛋白、藻蓝蛋白、藻红蓝蛋白和别藻蓝蛋白等（王庭健等，2006），通过连接多肽组成高度有序的超分子复合物——藻胆体（Phycobilisomes，PBS），并由“锚蛋白”将其“锚”在光合膜的表面。在隐藻中，可溶性的藻胆蛋白结合于光合膜内，与脂溶性的叶绿素蛋白质复合物协同作用组成捕光色素系统，才形成藻胆体结构。藻胆蛋白是一种古老的蛋白，在原始海洋出现蓝藻时就有了这种蛋白。在叶绿素出现以前，藻胆蛋白是主要的捕光色素蛋白，因此开展藻胆蛋白的研究不仅可以深入探讨光合作用捕光和传能机理，而且可以追溯光合作用和光合生物的进化历程。

早期人们在研究丝状蓝藻在入射光下的光合放氧时发现，用570～630nm之间的光照射藻体，其放氧效率与利用叶绿素吸光区域（430～470nm和650～680nm）的光照射藻体时的放氧效率相同。该实验结果提醒人们在蓝藻中叶绿素a之外可能存在其他光合色素，此后研究单细胞蓝藻时对该结果给予了定量的解释。至此，藻胆蛋白在藻细胞中作为捕光色素系统的理论才被人们接受。此外，藻胆蛋白也是细胞中的氮源存储蛋白。魏晓琳（2014）对不同光照强度下蓝藻的光合途径进行了研究，发现弱光下光能传递机理为：光能—大部分叶绿素a、β-胡萝卜素—叶绿素a。强光下光能传递机理为：光能—叶绿素b、类胡萝卜素、大部分叶绿素a—叶绿素a。弱光下藻蓝蛋白浓度较高，并且只含有C-藻蓝蛋白一种，强光下藻种中未发现藻蓝蛋白（魏晓琳，2014）。具有不同聚集态的藻胆蛋白有着不同的摩尔消光系数。这些聚集态决定了引起各藻胆蛋白之间光谱特性差别的藻蓝胆素发色团的构象。研究表明，在高聚态的C-藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白中，蛋白质—发色团之间相互作用调制的发色团的构象，对太阳能的吸收和激发能转移到光合反应中心的过程可能有重要作用。藻类的捕光系统是由棒状的藻胆体构成的，藻胆体又是由不同的藻胆蛋白按照一定的顺序排列而成的，藻红蛋白位于藻胆体的尖端，蓝蛋白位于中间，藻蓝蛋白形成核心附着在类囊体的基质膜上，与光反应中心相连。光能由藻红蛋白传递到藻蓝蛋白，再传递到别藻蓝蛋白，后传递到光反应中心，效率接近100%（梁栋材等，1998）。

研究发现，藻胆蛋白不仅具有良好的捕光活性，而且在抗病毒、抗肿瘤、提高机体免疫力、消炎和抗氧化等方面具有很好的效果。目前，藻胆蛋白既可作为天然色素应用于食品、化妆品和染料等工业，又可作为重要的生理活性物质应用到食品和药品，用于医疗保健上，还可制成荧光试剂、光敏剂等。作为荧光探针与光敏化剂，藻胆蛋白在生物、医学荧光标记分析与光敏化抗肿瘤研究等方面应用广泛。在临床医学诊断、免疫化学、生物工程等研究领域以及保健食品生产等方面也得到了广泛的应用，同时在癌症治疗和分子检测研究方面也受到极大重视。藻蓝蛋白是一种水溶性色素蛋白，颜色鲜艳，可作为天然食用色素改善食品色泽。藻胆蛋白具有高量子产率、高稳定性等优点，目前在生物学研究的主要应用领域包括流式细胞荧光测定（FACS）、荧光免疫检测（FIA）、单分子检测（SMD）等。藻胆蛋白在各领域应用的进展依赖于对其结构和光谱特性的全面了解。随着基因重组技术的发展，除了天然藻胆蛋白外，现在人们通过基因重组技术制备了很多种类的重组藻胆蛋白（张晓平等，2015）。有实验证明重组藻胆蛋白的某些生物活性要高于天然的藻胆蛋白。而且，重组藻胆蛋白在工程菌内表达量高、纯度高。因此，重组藻胆蛋白的研究将成为未来藻胆蛋白研究领域的一个热点。

藻胆蛋白一般存在于类囊体腔中，但是它的状态目前尚无定论。徐伟等（2015）以蓝隐藻类囊体膜为研究材料，通过测定其室温吸收光谱、荧光谱以及77K低温荧光光谱，分析了藻蓝蛋白在类囊体腔中的存在状态。研究发现，有一定量的藻蓝蛋白始终紧密结合在类囊体膜上，而且与类囊体膜的接触并非完全无倾向性排布。与类囊体膜发生接触的可能是藻蓝蛋白上的β亚基。藻胆蛋白在藻类中的含量并不是固定不变的，而是处于一种动态变化中。刘慧等（2013）发现低质量浓度的Ca2+能促进螺旋藻的生长，0.1g/L 的Ca2+对螺旋藻生长的促进效果最大，藻胆蛋白的含量也最高；当Ca2+质量浓度高于0.1g/L时，对螺旋藻的生长影响不明显。其他微量元素和营养物质的含量水平也会影响微藻中藻胆蛋白的含量。

1.藻胆蛋白的种类

依据藻胆蛋白色基的光谱特点和结构组成，可将藻胆蛋白分为三种主要类型：藻红蛋白（PE，phycoerythrin）、藻蓝蛋白（PC，phycocyanin）和别藻蓝蛋白（APC，allophycocyanin）。其中藻蓝蛋白（PC）和别藻蓝蛋白（APC）主要存在于所有红蓝藻中，藻红蛋白（PE）则存在于部分蓝藻和红藻中。在部分蓝藻中，例如蓝藻层里鞭枝藻（Mastigocladus laminosus）中，还含有一种较为少见的种类——藻红蓝蛋白（PEC，phycoerythrocyanin）（Bryant D A，1982）。

由于不同的藻胆蛋白所含色基的种类不同，并且色基所处的蛋白质高级结构也不尽相同，因此藻胆蛋白表现出来的颜色也有差异，如藻蓝蛋白主要呈现蓝色，藻红蛋白主要呈现红色，别藻蓝蛋白则呈现淡蓝色。由于藻胆蛋白主要存在于蓝藻、红藻中，所以根据其来源，藻胆蛋白主要分为两类，每一类前分别以字母来区分。例如，来源于红藻门（Rhodophyta）的藻胆蛋白体前缀为R，来源于蓝藻门（Cyanophyta）的藻胆蛋白前缀为C（Tandeau，2003）。随着对藻胆蛋白研究的深入，科研人员发现藻胆蛋白曾经认为只属于某一门的藻胆蛋白体，也可以存在于其他门中，例如存在于蓝藻中的C-藻蓝蛋白，在红藻门中也被发现（Kur sar T A，1983）。所以现在用光谱特性而非来源对藻胆蛋白进行分类（Tandeau，2003）。例如藻红蛋白，根据其吸收光谱、荧光光谱等特性，可以分为R-藻红蛋白、C-藻红蛋白、B-藻红蛋白和b-藻红蛋白四类；藻蓝蛋白可以分为R-藻蓝蛋白和C-藻蓝蛋白；别藻蓝蛋白则可分为APC和APC-Ⅱ等。根据每一类藻胆蛋白光谱性质的细微差异，R-藻红蛋白还可以分为R-藻红蛋白Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ等4种类型（Mac coll R等，1996）；C-藻红蛋白可以分为C-PE-Ⅰ，Ⅱ等类型；R-藻蓝蛋白可以分为R-PC-Ⅰ，Ⅱ等类型（表4-1）。

表4-1　不同类型藻胆蛋白的结构组成、吸收光谱和荧光光谱特性及色基组成（苏海楠，2010）

重组藻胆蛋白：虽然藻胆蛋白用途非常广泛，但是天然藻胆蛋白稳定性不高，容易变性。同时，由于藻类其他蛋白种类较多，为天然藻胆蛋白的分离纯化带来了诸多不便。以药物研发方面为例，针对天然藻胆蛋白的开发存在较多问题，例如分离纯化成本较高、纯化后的蛋白杂质较多、开发周期长等。但是随着基因重组技术的逐渐进步，通过基因工程菌株可以表达出新型的基因重组藻胆蛋白，基因技术的加入，拓宽了藻胆蛋白的研究领域，加深了对天然藻胆蛋白结构和功能的认识，也推动了藻胆蛋白在食品、药品、化妆品等行业中的应用。以别藻蓝蛋白（APC）为例，APC是藻胆蛋白中的一种，目前获得别藻蓝蛋白的方法主要是从红藻和蓝藻中提取，但是这种方法获取周期长、分离纯化困难、制备成本高，大大限制了别藻蓝蛋白的应用，因此，研究人员将目光投向了通过生物学基因克隆手段获得的重组别藻蓝蛋白。通过比对两种不同藻种集胞藻（Synechocystis sp.PCC 6803）和嗜热藻（Thermosynechococcus elongatus BP-1）别藻蓝蛋白β-亚基的氨基酸序列，最后获得了11个位点的14个定点突变体，并证明这11个位点与别藻蓝蛋白热稳定性有关。在其结构水平分析中，通过追踪重组别藻蓝蛋白合成的整个生物反应过程，对过程中与重组别藻蓝蛋白稳定性相关的因素进行试验分析，发现色基结合率的高低以及所处的蛋白空间结构很大程度影响藻胆蛋白稳定性和光能传递能力的强弱，色基结合率越高，蛋白结构越完整，从而藻胆蛋白稳定性越好，能量吸收传递效率越高（周孙林，2014）。

2.提取、分离及纯化

藻胆蛋白的分离纯化方法最早是由Glazer和Fang基于分离血红蛋白亚基的方法而创立的。不同藻类中藻胆蛋白的提取、分离及纯化的方法各不相同。我国的藻类资源丰富，藻胆蛋白的提取纯化技术的发展会在一定程度上促进我国藻类资源深加工技术的进步。因此，如何克服传统技术的缺陷、减少操作步骤、提高产品的纯度及回收率，并实现规模化生产，对我国藻类资源的开发和利用具有十分重要的意义。藻胆蛋白的提取、分离及纯化大体上可以分为3个阶段：①细胞破碎，②粗蛋白的提取，③粗蛋白的分离及纯化。不同的提取和分离方法会对藻胆蛋白的活性产生不同程度的影响。程超等（2014）以对O2-·的清除能力为指标探究了不同提取方法对藻胆蛋白活性的影响。研究表明，反复冻融法没有影响藻胆蛋白的活性，缓冲液作为浸提液会增强藻胆蛋白对O2-·的清除作用；同时不同pH缓冲液浸提液中，由于藻胆蛋白的聚合度不同，导致其对O2-·清除作用也有所差异。

（1）粗提取方法：藻胆蛋白是一种胞内蛋白，如何选择合适的破碎条件，将藻胆蛋白释放到溶液中，然后通过分离纯化回收天然的藻胆蛋白，同时还要保持其原有结构和功能，是整个藻胆蛋白提取纯化过程中的重要步骤。通常藻体破碎的程度越高，最终藻胆蛋白的得率越高（朱丽萍等，2009），但是剧烈的细胞破碎方法也会导致多糖等杂质的大量析出，从而加大分离纯化的难度。目前较为传统的破碎藻体的方法主要有机械研磨法、高压匀浆法（Patil等，2006）、反复冻融法、浸泡法和压强破碎法等。这些方法在破碎藻体细胞时，制约因素如所需时间、破碎规模和回收率等不尽相同。但是随着相关提取技术的发展，超声破碎法和酶解法等被广泛应用到藻胆蛋白的分离纯化过程中，这些技术在提高产品回收率、保持天然藻胆蛋白体活性以及规模化使用方面具有较大的优势，同时与传统破碎技术结合使用，可以实现高回收率藻胆蛋白体的规模化制备。目前常用的组合方式有：液氮研磨法和高压匀浆法、高压匀浆法和超声破碎法、超声破碎法（Bermejo等，2007；李文军，2013）和反复冻融法（Moraes等，2009）等。

①机械粉碎法。机械粉碎法是利用物体之间的相互运动所产生的挤压和切应力使藻细胞被破碎的方法。Moraes等（2009）通过球机械破碎螺旋藻，所得的藻胆蛋白粗提液中C-藻蓝蛋白纯度可达0.63。虽然在处理微藻时，机械粉碎法可以得到较好的效果，但在处理大型藻类时，机械破碎法通常只作为其破碎的第一步，通常需要与反复冻融法等其他方法联用，才能使细胞最终破碎，释放出藻胆蛋白。

②渗透压破碎法。渗透压破碎法是非机械破碎藻体细胞的一种较为温和的方法。将藻细胞放在高渗透压的蔗糖或者甘油溶液中，藻细胞内水分由于渗透压的作用向外渗出而发生收缩，然后将藻细胞转入缓冲液中，胞外的水由于渗透压的突然变化迅速渗入胞内，引起藻细胞快速膨胀、破裂，释放出藻胆蛋白体。Niu等（2007）等通过蒸馏水渗透处理所得的C-藻蓝蛋白纯度可达0.69，Soni等（2006）发现低浓度蔗糖溶液处理后的藻体细胞与反复冻融法的破碎效果相似。渗透压破碎法虽然操作简单，可以大规模处理藻类细胞，但是破碎的时间较长，通常在3d左右（朱丽萍等，2009）。

③反复冻融法。反复冻融法是藻胆蛋白提取时较为常用的藻体细胞破碎方法，在操作过程中采用反复冷冻与融化，由于细胞中形成了大量冰晶，同时剩余液体中高浓度的盐可以使细胞破裂，通常先将藻体在-25℃冷冻，然后放置在4℃冰箱中融化。需要注意的是，在融化过程中温度不可以太高，以防止藻胆蛋白产生变性，影响其结构和功能活性。Niu等（2007）通过反复冻融法从螺旋藻中提取的C-藻蓝蛋白产品纯度为0.59，Patel等（2005）将反复冻融法与超声破碎法相结合，经分离纯化所得的螺旋藻藻胆蛋白粗提液中C-藻蓝蛋白的纯度可达0.80，Soni等（2006）通过4次反复冻融循环从颤藻中获得的C-藻蓝蛋白纯度可以达到0.85。与其他破碎方法相比，反复冻融法相对较为温和，控制得当一般不会造成蛋白质变性，同时破碎效果也有较好的重现性。但由于反复冻融法的操作规模有限，对于大规模制备则很难实现，因而仅适用于实验室少量样品的处理。

④液氮研磨法。液氮研磨法在藻类细胞破碎中也经常被使用。液氮的温度为-196℃，这种低温条件下既能使藻类细胞组织成分不被破坏或降解，又能使其细胞壁变硬，增加其脆性，从而更使其在研磨过程中达到较好的破胞效果，使细胞内的藻胆蛋白释放出来。

Galland-Irmouli等（2000）用液氮将藻体磨碎后，再用缓冲液溶解，继续经过均质处理，测得粗提液中的藻红蛋白含量为1mg/ml；Soni等（2007）通过液氮处理，研磨藻细胞后获得的C-藻蓝蛋白粗提液纯度可达0.42。在液氮所提供的低温环境下，天然藻胆蛋白不易被降解，这有利于提高藻胆蛋白体的回收率，特别是与高压均质法相结合，可以得到很好的破碎效果。但是同时也要注意，低温造成的冰晶也可能会对藻胆蛋白体的空间结构产生影响。

⑤超声破碎法。超声波是由声波发生器产生的，通常来说，频率越高，藻体破碎效果越大，使用超声破碎法一般不会引入外源杂质。Benavides等（2006）通过实验证明，在从紫球藻中提取B-藻红蛋白的时候，超声破碎法所得B-藻红蛋白的回收率为去离子水浸泡的5倍。Niu等（2007）用超声破碎法提取螺旋藻中C-藻蓝蛋白，藻蓝蛋白纯度可达0.67，和蒸馏水渗透压破碎法处理所得到的效果相当。所以即使运用相同的技术处理不同的样本，破碎结果也是不同的。超声破碎法在操作的过程中尤其需要注意的是，当超声频率较高时，细胞破碎剧烈，同时释放出大量的蛋白和多糖，不仅导致粗提液的黏稠度增加，而且成分复杂的混合物也导致了下一步纯化难度加大。同时，剧烈的破碎过程，也可导致蛋白质高级结构的解聚和空间结构的改变，从而影响其生物活性。

⑥高压匀浆法。高压匀浆器是藻体细胞破碎常用的设备，一般由正向排代泵和排出阀组成，正向排代泵可产生高压，排出阀则具有狭窄的小孔，并且大小可以调节。藻液先通过止逆阀进入泵体内，然后打开排出阀，细胞在高压下从小孔中高速冲出与撞击环碰撞，细胞经过减压和高速冲击所产生的液相剪切力而破碎。Patil等（2006）利用该方法将螺旋藻在200～400kg/cm2下处理5min，离心后所得C-藻蓝蛋白纯度可达1.18，别藻蓝蛋白纯度可达0.41。高压匀浆法也可与反复冻融等方法结合使用（Galland-Irmouli等，2000），可以在较为温和的情况下释放藻体中的藻胆蛋白，并保持其天然活性。

⑦溶菌酶法。溶菌酶法破壁虽然是被广泛应用的生物技术（陈艳，2009），但在藻类细胞破碎的应用中还不多。该方法耗费较高，酶解时间长。溶菌酶法相对于其他破碎方法，所需要的时间更长，而且酶解的温度、pH等环境，会造成藻胆蛋白的构象和结构的改变。

（2）分离纯化方法：按纯化原理的不同，藻体细胞破碎后的分离纯化方法大体可分为三类：a.根据藻胆蛋白分子量大小不同的分离纯化技术；b.依据藻胆蛋白体电荷离子特性的色谱纯化技术；c.根据藻胆蛋白在不同介质中溶解度不同的萃取分离和盐析技术等。其中离子交换层析技术、分子筛技术和双水相萃取技术等与硫酸铵盐析、超滤等技术联用，是目前纯化效果较好的分离方法，通过多步操作可以获得纯度较高的藻胆蛋白（Moraes，2009；王超，2011）。

①硫酸铵分段盐析法。硫酸铵盐析法是指向藻胆蛋白体溶液中加入高浓度的硫酸铵，破坏藻胆蛋白的胶体稳定性，使其溶解度降低而从介质中析出。由于藻胆蛋白体水溶性较好，通过逐渐增加粗提液中硫酸铵的浓度，便可将粗提液中的水溶性差的蛋白质分开，经过离心操作，可以得到藻胆蛋白的固态沉淀，同时达到浓缩藻胆蛋白的目的。此外，由于不同的藻胆蛋白分子量、电荷、聚合程度不尽相同，通常电荷较多、分子量较大的藻胆蛋白，在粗提液中沉淀所需的硫酸铵浓度也较低，所以硫酸铵分段盐析也可以用于不同藻胆蛋白间的初步分离。

根据何培民等（2006）的研究，在提取条斑紫菜中的藻胆蛋白时，当溶液中硫酸铵分段浓度在25%～35%饱和度时，大部分藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白析出；当溶液中硫酸铵分段浓度在25%～45%饱和度时，大多数藻红蛋白可以被沉淀下来；当硫酸铵浓度达到55%饱和度的时候，大多数藻胆蛋白都可以被析出。在海洋蓝隐藻（Chroomonas placoidea，T13）中，当硫酸铵分段浓度分别为50%～70%、70%～80%、80%～100%时，所收集的粗提液中藻蓝蛋白-645的纯度逐渐增加，50%～70%硫酸铵沉淀的粗提液含有大量的叶绿素成分，显黄绿色，70%～80%硫酸铵沉淀的沉淀黄绿色已经不明显，80%～100%硫酸铵沉淀的沉淀已显天蓝色，A645/280在3.0左右，所含杂蛋白很少（李文军等，2013）。Soni等（2008）将反复冻融后所得到的藻胆蛋白粗提液分别经20%、70%饱和度的硫酸铵溶液处理后，蛋白纯度由0.85增加到1.26（Soni B等，2008）。Moraes等（2009）发现若减少硫酸铵盐析过程，分离纯化所得到的藻胆蛋白纯度和回收率会明显降低。

②超滤法。超滤可以用于截留溶液中较大的颗粒，水和低分子量溶质则允许穿过膜，其原理是指由膜孔阻滞、膜表面机械筛分和膜孔吸附的综合作用。由于超滤法是通过物理性障碍来截留大分子量物质，处理方式较为温和，因此一般不会引起藻胆蛋白结构和性质的改变。Denis等（2009）比较了膜超滤技术和硫酸铵沉淀法对蜈蚣藻中R-藻红蛋白的提取效果，其中超滤法和80%的硫酸铵沉淀法效果较好，可以将粗提液中藻红蛋白的纯度提升到0.9。由于超滤法可以实现大规模藻胆蛋白粗提液的分离，操作简单，因此具有较大的应用潜力。

③凝胶过滤法。凝胶过滤法中所使用的凝胶，具有一定大小的网孔，该网孔只允许相应大小的蛋白分子进入凝胶颗粒内部，大分子则被阻滞在凝胶外部，当用洗脱液进行洗脱时，大分子蛋白随洗脱液从凝胶颗粒间隙穿过，小分子的蛋白质则在凝胶颗粒网状结构中受到阻滞，晚于大分子蛋白后洗脱下来，从而达到分离的目的。相比于其他方法，凝胶过滤的生产规模不大，成本较高，但凝胶过滤法与其他纯化技术连用时，可以达到较好的分离效果。如Moraes等（2009）使用Sephacryl S-100HR填充的凝胶柱对螺旋藻中C-藻蓝蛋白进行凝胶过滤处理时，通过与硫酸铵盐析和离子交换层析连用，可以获得较纯的藻蓝蛋白；Soni等（2006）在从颤藻中纯化C-藻蓝蛋白时，将藻胆蛋白体粗提液经过硫酸铵沉淀后，用缓冲液溶解，经过Sephadex G-150填充的凝胶柱进行过滤层析，然后将收集到的藻蓝蛋白继续用离子交换层析纯化，最终将C-藻蓝蛋白的纯度提高到2.26。

④羟基磷灰石柱层析法。羟基磷灰石柱层析法主要靠磷酸根离子和钙离子的静电引力实行对蛋白进行吸附，也是藻胆蛋白分离纯化经常使用的方法。但是该方法也需要与其他方法进行连用，不宜大规模纯化，因此一般在实验室较为常用。在从多管藻中分离纯化R-藻红蛋白时经羟基磷灰石柱层析分离纯化后，藻红蛋白的纯度可达4.34；Niu等（2006）也曾用羟基磷灰石柱层析法对螺旋藻中C-藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白进行分离。

⑤疏水层析法。疏水层析（hydrophobic interaction chromatography，HIC）是利用固定相凝胶载体上偶联的疏水性配基与流动相中的一些疏水性蛋白质发生可逆性结合，从而将不同疏水性质的蛋白混合物进行分离。由于藻胆蛋白具有疏水差异，在高盐溶液中，疏水性强的蛋白会与疏水配基先结合，此方案常用于藻胆蛋白体粗提液经硫酸铵盐析之后的进一步纯化。Soni等（2008）利用疏水层析最终将C-藻蓝蛋白的纯度由0.86提升到4.52；Santiago-Santos等（2004）通过甲基化大孔制备型疏水性介质处理藻胆蛋白粗提液，将Calothrix sp.中C-藻蓝蛋白的纯度由0.4提高至3.5。

⑥离子交换层析法。离子交换层析（ion exchange chromatography，简称为IEC）的固定相是离子交换剂，当流动相中的蛋白质混合物流经交换剂时候，不同蛋白分子由于所带电荷情况不同，造成结合力大小不同，从而可以用于藻胆蛋白的分离纯化。虽然离子交换层析介质成本较高，但是在藻胆蛋白分离纯化过程中，效果较好，例如Sepharose Fast Flow离子交换介质已被广泛应用到藻胆蛋白的纯化过程中。Moraes等（2009）在从螺旋藻中提取C-藻蓝蛋白时发现，使用离子交换层析方法能够获得更纯的C-藻蓝蛋白。Patil等（2006）通过DEAE-Sephadex离子交换层析，也使C-藻蓝蛋白的纯度从5.22增加至6.69。

⑦双水相技术。双水相萃取（aqueous two phase extraction，ATPE）是依据物质在两相间的分配的选择性。藻胆蛋白体蛋白的分配系数取决于蛋白与双水相系统间的静电、疏水、生物亲和等各种相互作用，由于不同的蛋白质的分配系数不相同（在0.1～ 10之间），因而双水相体系对不同类型和结构的蛋白的分配具有较好的选择性（冯维希等，2010）。作为一种新型的分离技术，双水相萃取法在藻胆蛋白提纯中具有较好的特点：a.系统含水量较高，有助于保持藻胆蛋白生物活性；b.萃取可以在很短的时间内达到平衡，分相时间短；c.易于大规模分离纯化（王超等，2011）。

⑧反胶团萃取技术。反胶团萃取（reversed micellar extraction）是一种新型的生物分离技术。反胶团萃取的原理仍是液-液有机溶剂萃取，利用表面活性剂在有机相中构建反胶团，反胶团成为有机相中的亲水微环境，使水溶性蛋白在有机相内吸附在反胶团的亲水微环境中，并且反胶团萃取所需要的操作条件较为温和、流程简单、易于大规模制备，藻胆蛋白在分离过程中也不易变性，尤其对工程菌株发酵液中的转基因表达产物有良好的纯化效果（刘杨等，2008）。

⑨基于磁性纳米颗粒的荧光藻胆蛋白制备分离。生物纳米技术的快速发展为生物大分子的分离纯化提供了新的技术方法。其中，磁性纳米颗粒由于具有特殊的磁响应特性，可以应用到藻胆蛋白的分离纯化中。陈英杰等（2011）将基因重组技术和生物纳米技术相结合，利用磁性纳米颗粒的磁相应特性，进行了磁性纳米颗粒的制备和研究。利用金属离子的螯合作用，陈英杰将锌离子修饰的磁性纳米颗粒表面，然后用双标签标记的转基因别藻蓝蛋白固定，制备出一种粒径为20nm±5nm的红色荧光超顺磁性球状材料。该荧光磁性纳米颗粒能够与酶亲和素进行结合。实验结果表明，该磁性纳米颗粒可以通过免疫结合反应，对特殊标记的转基因表达藻胆蛋白进行快速识别和纯化。

⑩等电点沉降法。蛋白质等电点沉降法是利用不同藻胆蛋白在各自的等电点处溶解度最小、在低温下析出的原理，对藻胆蛋白体进行分离纯化。朱劼等（2011）采用超声波协同等电点沉淀法从螺旋藻粉中提取藻蓝蛋白，并对其工艺进行优化，为工业化生产提供理论参考。在最佳分离条件下粗蛋白得率最大达到52.5%。其中藻蓝蛋白的含量为7.7%，提取率为92.7%。

3.组成和结构

不同类型的藻胆蛋白在一级结构的氨基酸残基序列上有较大差别，但是它们起重要作用的关键位点氨基酸残基是非常保守的。通过对藻胆蛋白的序列和高级结构进行分析，一般认为有一个共同的藻胆蛋白祖先进化出了目前的各种藻胆蛋白，进化顺序依次为C-藻蓝蛋白、R-藻蓝蛋白、藻红蛋白。藻胆蛋白的基本组成为两种亚基，分别命名为α和β亚基，分子量均在为1.5万～2.0万之间，一个α亚基和一个β亚基通过相互作用连接在一起构成藻胆蛋白的基本单体。在藻红蛋白中，除了α和β亚基外，还存在一种分子量约为3.0万的γ亚基。各种藻胆蛋白的氨基酸数量不同，一般情况下，α亚基含有161～164个氨基酸，β亚基含有161～177个氨基酸，γ亚基含有317～319个氨基酸。每个亚基由一个脱辅基蛋白（apoprotein）和1～5个开链的四吡咯环发色团——藻胆素（Phycobilin）组成，藻胆素通过硫醚键与脱辅基蛋白的半胱氨酸残基共价连接。藻胆色素与脱辅基藻胆蛋白的正确连接一般都需要特异的裂合酶来催化完成。目前已发现裂合酶CpcE/F催化脱辅基蛋白CpeA与藻蓝色素PCB的连接，裂合酶PecE/F催化PCB异构为PVB并与脱辅基蛋白PecA连接。裂合酶CpeSl不仅催化PCB与CpcB和PecB 的Cys-84位连接，同时也能催化PCB与脱辅基蛋白ApcA，ApcB，ApcA2，ApcD，ApcF的连接。裂合酶CpeTl能催化CpcB和PecB的β亚基Cys-155位与藻蓝色素PCB的偶联（陈煜，2012）。

藻胆蛋白的α和β组成的单体在藻体内会以更稳定的（αβ）n聚集态存在，例如，蓝藻和红藻中常见的藻胆蛋白经常以（αβ）六聚体和（αβ）三聚体聚合形式存在，在隐藻中藻胆蛋白以（αβ）二聚体为主。此外，在多数藻红蛋白中还含有一种γ亚基，每个γ亚基一般与一个（αβ）六聚体结合保持稳定状态；在b-藻红蛋白则没有γ亚基，所以其稳定聚集态一般为（αβ）三聚体；此外，γ亚基具有不同种类，分布在不同的红藻种类中。

在实验中分离纯化得到的藻胆蛋白的光谱特征，往往因为藻胆蛋白所处的聚集状态不同而不同。藻胆蛋白的聚集状态不仅与其种类有关，而且还与其浓度、缓冲液的pH以及所处环境的离子浓度相关，即使在相同条件下，同种藻胆蛋白的不同聚集状态也会同时存在，之间存在着一种动态平衡关系（张晓平等，2015）。

藻胆蛋白是由脱辅基蛋白和开链四吡咯环结构的色基组成（图4-1），产品颜色来源于其共价连接的藻胆素色基（phycobilin），藻胆蛋白间颜色的差别则是由结合藻胆素分子的数量和种类不同造成。藻胆色素通过硫醚键共价结合在脱辅基蛋白的半胱氨酸残基上。藻胆素的种类和数量决定了藻胆蛋白的吸收光谱性质和荧光光谱性质。至今为止，常见的藻胆素有4种，分别是藻蓝胆素（phycocyanobilin，PCB）、藻红胆素（phycoerythrobilin，PEB）、藻尿胆素（phycourobilin，PUB）和藻紫胆素（phycobiliviolin，PXB或PVB），它们的最大吸收峰分别为620～650nm（PCB）、540～565nm（PEB）、568nm（PXB）和490nm（PUB）（朱丽萍等，2009）。在隐藻中发现至少有以下几种藻胆素，包括藻蓝胆素（PCB）、藻红胆素（PEB）、藻紫胆素（PXB）、DBV（cryptoviolin15，16-dihydrobiliverdin，也称15，16-二氢胆绿素）和中胆绿素（mesobiliverdin，MBV）。

图4-1　藻胆素结构

经核磁共振光谱证实，这4种藻胆素分子的碳骨架相同，分子量大小约为58.6万，都含有2个酮基（C=O）、7个碳碳双键（C=C）等，差异仅表现在双键位置与数量的不同。仅仅是这个简单的差别，就造成了共轭双键的数目不同，共轭双键越多，色基的吸收波长就越红移。加之每种藻胆蛋白可以结合不同类型和数量的藻胆素色基，藻胆蛋白内部色基构象和微环境不同，藻胆蛋白聚集状态等原因（Holzwarth等，1991；Duerring等，1990；Demidov等，1995），藻胆素的吸收光谱范围几乎覆盖了从490nm（PUB）到650nm（PCB）广泛的可见光区。

同一种藻胆蛋白分子共价结合的色基不同，例如R-PE和B-PE中通常同时具有PUB、PEB，PC-645同时含有DBV、MBV和PCB。按照功能的不同，可以将色基分为两种类型：一种能吸收能量并相应地产生荧光的“荧光型”色基（f）；另一种称为“敏化型”色基，它能吸收能量并将吸收的能量快速高效地传递给“荧光型”色基，而自身不能产生荧光。藻胆蛋白的色基大多是以硫醚键的形式与藻胆蛋白的脱辅基蛋白上的半胱氨酸残基（Cys）相连，有时PEB色基和PXB会与两个Cys残基以双键的方式相连接。藻胆蛋白对光照、pH、温度等外界条件比较敏感。在强光照、强酸强碱、高温等条件下，藻胆蛋白的空间结构极易发生变化，进而丧失其生物活性。程超等研究了pH、温度和光照对藻蓝蛋白的影响，为探讨高效利用藻胆蛋白提供了参考（程超等，2014）。藻胆蛋白稳定性相对较差，并且对光强度、温度和所处溶液的pH、离子强度都较为敏感，高坤煌等（2014）利用喷雾法制备了藻胆蛋白微胶囊，从而为藻胆蛋白的存储和研究提供了新的方法。

曲艳艳等（2013）利用聚丙烯酰胺凝胶电泳、等点聚焦、二维电泳分析等技术对海洋大型红藻多管藻（Polysiphonia urceolata）藻蓝蛋白的结构进行了研究。结果表明，PC含有1种分子质量为1.82万、pI为6.5的α亚基，含有分子质量为2万和2.09万、pI为5.5和5.6的4种β亚基。王广策等（2001）将紫球藻（Porphyridium cruentum）B-藻红蛋白和多管藻（Polysiphonia urceolata）R-藻红蛋白经蛋白酶K部分酶切消化后，分离得到近似天然态的γ亚基，且对它的光谱特性以及在藻红蛋白分子中的空间位置进行了研究。动力学分析表明，γ亚基位于R-藻红蛋白和B-藻红蛋白六聚体（αβ）6的中央空洞中。分离的γ亚基上藻红胆素的吸收峰位于589nm，光发射峰位于620nm，蓝蛋白的吸收峰重叠，有助于藻胆体中藻红蛋白与藻蓝蛋白分子间高效能量传递。

4.生理活性

（1）藻胆蛋白对细胞增殖和机体免疫的刺激作用：1988年，Shinohara等发现藻胆蛋白能够促进一种人骨髓瘤细胞RPMI8226的生长，Shinohara等同时比较了来源不同的藻胆蛋白对于细胞作用的强弱，发现不同藻胆蛋白的刺激细胞生长的作用强度由大到小分别为：别藻蓝蛋白、藻蓝蛋白、藻红蛋白。汤国枝等（1994）也曾经报道，在钝顶螺旋藻中能够分离得到一种藻胆蛋白组分，分子量约为1.5万，该藻胆蛋白组分具有刺激红细胞集落生成的作用。

（2）藻胆蛋白的抗病毒活性：Chueh等（2003）曾报道别藻蓝蛋白具有一定的抗病毒活性，该别藻蓝蛋白是从钝顶螺旋藻中提取的，在对非洲绿猴肾细胞的病毒和肠道病横纹肌肉瘤细胞活性试验中，发现别藻蓝蛋白对病毒的压制的半数有效抑制浓度为（0.045±0.012） mmol/L。并且实验进一步表明，在细胞受病毒感染前用别藻蓝蛋白处理，效果比病毒感染后才处理效果要好一些。

（3）藻胆蛋白的抗氧化和消炎活性：自由基，是指化合物的分子在外界条件下，共价键发生均裂而形成的具有不成对电子的原子或基团，因为存在未成对电子，自由基性质非常活泼。尽管通常情况下，生物体内自由基浓度很低，存留时间也很短，但自由基代谢的动态平衡却是维系生命健康的基本要素，自由基过多很容易引起生物膜和生物大分子的氧化损伤。自由基生物学和医学研究表明，自由基所造成的氧化损伤不仅可能引起心脑血管疾病和肿瘤的发生，而且还与生物衰老过程密切相关（Floud，1990）。生物体内通过代谢，能够产生羟自由基，羟自由基可对磷脂、DNA、蛋白质等分子造成损伤，从而导致一系列病理生理过程。所以，如果能找到具有清除羟自由基的生物活性物质，则在生物制药上具有重要的意义。张素萍等（2000）曾针对3种不同的藻胆蛋白，开展羟自由基相关实验，据报道，这3种藻胆蛋白对羟自由基都有较强的清除作用。Romay等（1998）曾从蓝藻Arthospira maxima中分离纯化得到藻蓝蛋白，通过开展相关实验，结果表明藻蓝蛋白可能通过清除OH-和RO-自由基，产生抗氧化和消炎等作用。此外，藻蓝蛋白对肝脏微粒脂过氧化物生成也具有抑制作用。

黄峰等（2015）曾想培养的螺旋藻中，在培养液中加入一定量的硒元素，螺旋藻在代谢过程中，能够对硒产生富集作用，经过分离纯化后，获得富硒的藻蓝蛋白。经研究发现，富硒藻蓝蛋白对羟自由基和超氧阴离子都有较强的清除能力。(www.xing528.com)

Romay等（2000）在采用多种动物造模方式时，研究了藻蓝蛋白在动物体内抗炎症的活性，结果表明藻蓝蛋白在动物体内没有任何毒性，而且藻蓝蛋白在所有模型鼠体内都具有较为明显的消炎作用，消炎的效果与藻蓝蛋白成正比。Romay等（2000）在大鼠耳炎模型的研究中发现，藻蓝蛋白能够减轻炎症组织的水肿，降低髓过氧化物酶的活性；在大鼠结肠炎模型中通过组织病理和超微结构的观察，发现藻蓝蛋白不但具有清除自由基的作用，而且能够抑制炎症反应细胞的浸润并降低结肠的损伤。因此，Romay等（2000）指出，藻蓝蛋白具有清除自由基的能力，所以产生抗炎症活性。螺旋藻是一种古老的低等原核藻类，粗蛋白含量高达细胞干重的50%以上，其中又以藻胆蛋白含量为最高。张少斌等（2015）从螺旋藻新鲜藻泥中提取藻胆蛋白，并对酶解制备活性肽的工艺进行研究。以·OH清除率为评价指标，应用单因素试验和多因素正交试验相结合的方法，确定中性蛋白酶酶解螺旋藻藻胆蛋白制备抗氧化活性肽的工艺条件。

（4）藻胆蛋白的抗肿瘤作用：肿瘤是机体在各种致瘤因素作用下，局部组织的细胞在基因水平上失去对其生长的正常调控，从而导致组织细胞异常增生与分化。肿瘤的生长不仅不受正常机体生理调节，而且破坏正常组织与器官。尤其是恶性肿瘤，其生长速度快，呈浸润性生长，易发生出血和坏死。恶性肿瘤具有远处转移的能力，可以造成人体产生严重的脏器功能受损，最终导致患者死亡。长期以来，人们在积极研究肿瘤致病因素的同时，也在努力开发抗肿瘤的有效药物。现有的化学合成抗癌药，大部分对人体的正常细胞也产生非常强的毒副作用。藻类生物的多样性和特殊性，为寻找抗肿瘤活性物质提供了丰富的天然资源。因此，从藻类中寻找低毒性的抗肿瘤成分，也是近年来国内外藻类科学工作者研究的热点之一。

①藻胆蛋白对肿瘤的直接抑制作用。研究发现，藻胆蛋白对多种癌细胞和肿瘤都具有抑制作用，但是抑制肿瘤的作用机制方面较为复杂，目前的研究并不充分，需要进一步阐明。1986年，Schwartz在哈佛医学院报道过藻蓝蛋白对消化系统的肿瘤具有抑制作用；王勇等（2001）向在体外培养的HeLa细胞中加入藻蓝蛋白，随剂量从10mg/L增高至80mg/L，藻蓝蛋白对HeLa细胞的抑制率逐步提高，当采用流式细胞技术检测HeLa细胞所处的细胞周期时，发现藻蓝蛋白可以使HeLa细胞的DNA合成减慢；杨茜等（2013）以鄂尔多斯高原碱湖钝顶螺旋藻S1和非洲Chad湖钝顶螺旋藻S2为原料，提取了藻胆蛋白粗提液，经研究发现藻胆蛋白粗提液对人肝癌细胞系（HepG-2）和胃癌细胞系（MGC-803）癌细胞生长具有抑制作用。

②完整藻胆蛋白对癌症的治疗作用。光动力学疗法（photodynamic therapy，简称PDT）是近几年来发展起来的一种新型肿瘤疗法，基本原理是借助于在病灶区富集的光敏剂，经光照后产生自由基和活性态氧，对肿瘤组织进行氧化杀伤。光敏剂的选择是光动力疗法的核心，所以近年来高效、低毒、选择性好的光敏剂成为人们寻求的目标。由于藻胆蛋白含有开链吡咯发色团，与卟啉衍生物较为相似，在脱辅基蛋白的协助下形成的高级结构，使得发色团更加稳定，光能吸收和传递能力大大加强，使得藻胆蛋白可作为光敏剂而加以研究（张建平等，1999）。目前已从海洋生物蓝藻中提取的藻蓝蛋白，在国外已用于皮肤癌等肿瘤的光动力治疗，具有进一步推广应用的价值，所以其对癌症的光动力治疗已获得美国FDA的批准。藻蓝蛋白在我国也作为食品添加剂使用。有人认为藻胆蛋白可以作为光敏剂，不仅仅因为其具有光敏作用，也是由于它对肿瘤细胞比对正常细胞具有更强的亲和力，主要在病灶部位富集，虽然原因尚不清楚，但富集后的藻胆蛋白吸收光能后，由于缺少光能受体，在水溶液中导致自由基的产生，从而对肿瘤细胞产生氧化杀伤作用。最近对藻红蛋白的研究也表明，藻红蛋白可以通过光动力反应过程中产生的活性氧物质来引起肿瘤细胞凋亡，从而达到治疗目的。此外，藻胆蛋白还可以作为提高自身免疫作用的营养保健食品为人们所利用，有学者认为，含高浓度精氨酸和支链氨基酸的不平衡氨基酸可抑制肿瘤细胞的生长，藻胆蛋白具有抑制肿瘤生长的作用可能是因为富含较多的支链氨基酸和精氨酸的缘故（杨茵等，2013）。总的来说，藻胆蛋白可以通过多方面的共同作用达到治疗肿瘤的目的。

③重组脱辅基藻胆蛋白对癌症的治疗作用。2003年，赵方庆等（2003）研究了基因重组脱辅基别藻蓝蛋白亚基（rAPC，镭普克）的抑瘤作用，小鼠接种S 180瘤细胞后，10d内分别皮下及口服镭普克13.4mg/kg，6.7mg/kg，3.4mg/kg，第11天处死模型小鼠，称量肿瘤重量和胸腺重量，对白细胞进行计数。结果表明，镭普克对小鼠S180肉瘤有明显的抑制作用，瘤重抑制率可达45%～64%，并且在皮下以及口服均有效，同时对肉瘤小鼠的胸腺指数和白细胞数量无明显影响。唐志红等（2004）利用纯化的镭普克对小鼠H22肝癌的实验结果表明，当静脉注射剂量为50mg/（kg·d）时，抑瘤率可达62.2%。初步的免疫试验结果表明，镭普克对淋巴B细胞功能具有较强的增强作用。

（5）藻胆蛋白荧光特性的应用：藻胆蛋白具有水溶性好、无毒性、荧光量子产率高、斯托克位移大、荧光不易淬灭等优点，可以用作荧光染料。目前藻胆蛋白作为一种新型的性能优良的荧光探针，已经广泛应用于免疫组织化学、免疫细胞化学、流式细胞荧光测定、共聚焦激光显微镜、荧光激活细胞分选、单分子检测等荧光免疫分析测定。藻胆蛋白在激发光照射后，能发射出强烈的荧光，且荧光强度较高。藻胆蛋白在与其他蛋白共价交联后，荧光发射光谱和量子产额一般不会发生变化，所以Glazer（1982）最早提出藻胆蛋白可以应用于荧光探针。近年来藻胆蛋白作为新型荧光标记物，已经广泛用于临床诊断和生物工程研究中，例如藻胆蛋白与DNA分子、亲和素、单克隆抗体、生物素等结合制成荧光探针，可以用于荧光免疫检测、研究分子间相互作用、荧光显微镜检测、高通量药物靶标分子筛选等工作中。常规的放射性同位素标记法因有半衰期短、需要防护、废物处理困难等缺点，目前正在被荧光标记法所取代，如今Molecular Probe和美国的Sigma等公司都推出了相关产品（Guan等，2007；Su等，2005）。

免疫荧光检测法是使用时间较长的标记分析法，兼具有蛋白质结合的特异性及荧光检测的灵敏性，广泛应用于疾病检测中，特别是在疾病的发展过程、致病机理研究等方面具有独特的优势。免疫荧光检测法的特异性和敏感性主要依赖于荧光染料的质量。藻胆蛋白作为荧光探针应用于荧光分析检测，极大地提高了免疫荧光检测的灵敏度，促使多色荧光检测和能量共振转移（FRET）荧光探针检测成为现实（朱丽萍等，2011）。别藻蓝蛋白是优秀的发射红色荧光的染料，目前国外已将别藻蓝蛋白应用于流式细胞仪的荧光检测中，但由于别藻蓝蛋白天然存在量少，分离纯化困难，造成国际市场上别藻蓝蛋白售价很高，限制了其在生物检测中的应用。

（6）藻胆蛋白抗紫外活性：紫外辐射与皮肤的老化密切相关，而成纤维细胞是紫外线引发皮肤光老化的主要作用靶点，紫外线对成纤维细胞的主要表现在直接与生物大分子发生反应，引起DNA的损伤，从而造成成纤维细胞凋亡、数量减少、活性降低而导致胶原合成减少，致使皮肤张力和承受拉力降低（叶翠芳等，2013）。目前已经有相关人员建立了藻胆蛋白体在体外抗紫外损伤的细胞实验模型，从细胞学水平对藻胆蛋白的抗紫外的效果进行了评价，为其在紫外防护、细胞修复等方面的功效和在化妆品、保健品中的应用提供理论依据。藻胆蛋白作为天然植物源的活性物质，来源广泛，生物量大，有很好的潜在经济价值。

（7）抗肺纤维化作用：肺纤维化尤其是特发性肺纤维化（idiopathicpulmonary fibrosis，IPF）长期以来被认为是一种进行性发展、基本上不可逆的病理改变，IPF患者诊断后5年病死率达到65%，严重威胁公众健康。由于目前的治疗措施疗效甚微，IPF甚至还没有形成一个公认的治疗方案。近年来肺纤维化发病学的分子细胞生物学机制研究获得了较大进展，已经发现并确认了大量新的肺纤维化疾病的代谢通路作用靶点。针对这些信号靶点研发的新药已经在临床前和临床研究中被证明可能逆转或部分逆转肺纤维化病变。德国制药巨头勃林格殷格翰（Boehringer Ingelheim）也于2016年宣布，特发性肺纤维化治疗药物Ofev（nintedanib，尼达尼布）一项Ⅱ期TOMORROW临床试验和2项Ⅲ期INPULSIS临床试验的汇总分析数据，已发表于《呼吸医学》（Respiratory Medicine）。这些研究共纳入1231例IPF患者，其中723例接受Ofev治疗，508例接受安慰剂治疗。nintedanib分别于2014年10月和2015年1月获FDA和欧盟批准，用于特发性肺纤维化（IPF）的治疗。孙英新（2012）通过研究发现，螺旋藻藻蓝蛋白可以提高大鼠肺组织超氧化物歧化酶和血浆超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶的活性，降低大鼠肺组织羟脯氨酸、丙二醛和血浆丙二醛的含量，降低肺纤维化大鼠肺组织TGF-β1的蛋白水平，抑制NF-κB亚基p65及TNF-α活性，减轻百草枯中毒的大鼠肺肺泡炎症及后期肺纤维化的程度，对百草枯诱导的大鼠肺泡炎及肺纤维化具有显著的抑制作用，对百草枯中毒的大鼠有较好的治疗效果。该研究为藻蓝蛋白治疗百草枯中毒致肺纤维化提供了新的思路。

（8）藻胆蛋白对繁殖能力的影响：王塔娜等（2010）研究了节旋藻藻胆蛋白对果蝇性活力及繁殖能力的影响。以普通培养基为对照，在普通培养基添加不同浓度的节旋藻藻胆蛋白作为实验组，通过观察果蝇体重变化、交配率、子代雌雄果蝇数目，发现随着藻胆蛋白在培养基中浓度的上升，果蝇交配率也由8.9%上升到13.3%～31.1%，同时果蝇子代数较对照组增加了49.5%～77.7%，这表明藻胆蛋白能提高果蝇的性活力和繁殖能力。

（9）对神经元损伤的保护作用：缺血性脑血管病以死亡率高、致残率高、发病率高，严重危害人类的健康与寿命，对患者的生活能力及质量造成了严重的困扰。临床上表现为颈动脉或椎-基底动脉系统发生短暂性血液供应不足，引起局灶性脑缺血，导致突发的、短暂性、可逆性神经功能障碍。脑缺血损伤后神经元除坏死外，还以细胞凋亡的方式死亡。最近的研究表明，藻胆蛋白所具有的抗氧化和清除自由基的作用，可在红藻氨酸盐导致的大小鼠脑损伤中对神经元进行保护。陈红兵等（2004）通过观察藻蓝蛋白对大鼠局灶性脑缺血再灌流的影响，研究了藻胆蛋白对神经元损伤的保护作用。研究发现藻蓝蛋白能够降低髓过氧化物酶的活性，可以减轻组织水肿；在大鼠结肠炎模型中通过对组织病理切片的观察发现，藻蓝蛋白不仅能够降低髓过氧化物酶的活性，而且还能够降低结肠的损伤，抑制炎症反应细胞的浸润。

5.藻胆蛋白的应用

（1）藻胆蛋白在环境检测方面的应用：水体出现富营养化后，原有的生态平衡就会被破坏，一些藻类就会大量繁殖，出现水华或赤潮现象。如果能够提前预知藻类的分布和发展状况，就能提前做好防御措施，预防或控制灾情的发生。藻红蛋白和藻蓝蛋白是蓝藻重要的光合色素蛋白，有着自己独特的荧光光谱吸收峰和发射峰，因此可以使用荧光水质监测仪及时获取蓝藻生物量数据，并与3S技术结合，形成可视化的蓝藻浓度分布图，为水环境监测提供技术支撑（程宇凯等，2015）。

（2）生物电池：生物光电材料是一类新型光电信息转换、存储材料，生物光电材料对光信号响应的灵敏度高，并且没有污染，开发生物光电材料已成为材料与信息科学研究的前沿。细菌视紫红质是目前研究较为透彻的生物光电材料。某些蓝绿藻中的藻红蓝蛋白和细菌光敏色素这些蛋白质在细菌光合作用中具有很重要的作用，自身具有可逆光开关的特性，可开发为生物光电材料的新领域。

生物电池是指以生物材料为电解质的一种新型、绿色、环保电池。它能够利用光能，具有清洁无污染、高效、可循环利用等特点，在环保意识越来越强的当今社会受到广泛的关注。基于藻胆蛋白的高效捕光作用，人们利用富含藻胆蛋白的螺旋藻制备了螺旋藻生物太阳能电池。图4-2是一种常见类型的螺旋藻生物太阳能电池的结构示意图。

图4-2　螺旋藻生物太阳能电池的结构示意图（田亮，2014）
1.阴极 2.质子交换膜 3.阳极 4.参比电极
5.阳极电解液 6.螺旋藻 7.电化学工作站 8.进气管 9.阴极电解液

（3）光活化杀虫剂：目前常用的杀虫剂的主要成分大多是有机化合物，它们毒性大，而且不宜降解，在杀死害虫的同时也会对环境造成危害。开发新型的杀虫剂迫在眉睫。近年来，光活化杀虫剂逐渐成为研究的热点，它具有低毒、环境友好、高效等特点。目前普遍用来作为光活化杀虫剂研究的光敏剂有卟啉类、咕吨染料、植物源光毒素等。藻胆蛋白在光照条件下能够产生活性氧等自由基，产生光活化作用。产生的自由基能够促进细胞内脂质的过氧化，降低GSH的抗氧化能力，造成细胞损伤。因此，藻胆蛋白是一种潜在的光活化杀虫剂，能够克服化学农药带来的环境问题和耐药性问题（梁杰，2014）。

（4）藻胆蛋白-有机醇复合防冻剂：藻类经历了冰川时期一直存活至今，说明其在抗冻性上具有显著的优越性，而蛋白质是藻类的主要组成部分，因此藻蛋白在寒冷冰冻条件下也应具有很好的活性和稳定性。目前所用的融雪剂大部分是氯盐类，其融雪化冰简单实用，但会对路面、桥梁等建筑设施造成严重的结构性破坏，对土壤、水源等造成污染。王勇等从螺旋藻中粗提取藻蓝蛋白，再与一定比例的乙二醇、表面活性剂等混合制成一种复合防冻剂，既降低生产成本又保护环境。藻胆蛋白复合防冻剂既可以使蓝藻的污染得到较好的治理，使蓝藻变废为宝，又可以在一定程度上代替传统型氯盐类融雪剂和高成本的CMA类融雪剂，达到既降低生产成本又保护环境的目的（王勇等，2010）。

（5）氮库：PE是一种水溶性蛋白，一些类群中它可占藻体中水溶性蛋白的一半，因此可以作为氮源贮备库，为细胞生长发育提供必需成分。在一种隐藻中，要提供无机氮，PE便可在藻体中累积，达到15pg/细胞；培养基中氮源缺乏，PE迅速分解，量降低至0.05pg/细胞以下。鉴于其高蛋白含量，经有报道开展富含PE藻的养殖提供氮源。据报道，红藻Rhodosorus marinus中的PE含的酸性氨基酸量大于碱性氨基酸量，其中含有人体必需的7种氨基酸，但色氨酸含量少（隋正红等，1998）。

（二）其他藻类活性蛋白

1.蓝藻抗病毒蛋白CV-N

自从蓝藻抗病毒蛋白CV-N（cyanovirin-N，CV-N）从椭孢念珠藻（Nostoc elliposporum）中分离出以来，近年来得到了研究者们的重视。该蛋白多肽由101个氨基酸残基组成，分子量约为1.1万。CV-N在实验中表现出强烈的抗病毒活性，能够有效地抑制多个亚型的人类免疫缺陷病毒和猴免疫缺陷病毒；另外，CV-N对麻疹病毒和疱疹病毒HSV-6也具有明显的抑制作用。

2.糖蛋白

有人在蓝藻和其他藻类中发现糖蛋白（CBP），特别是与甘露糖和N-乙酰葡萄糖胺结合的糖蛋白表现出明显的抗人类免疫缺陷病毒活性。在人类免疫缺陷病毒试图逃过药物压力而脱掉其外壳后，该糖蛋白会启动一种有效免疫应答机制来抑制人类免疫缺陷病毒的活动。Mori等在一种海洋红藻（Griffithsia sp.）中分离到一种抗人类免疫缺陷病毒的蛋白（Grif-fithsin，GRFT）。经过实验研究显示GRFT既能干扰GP120120与CD4的结合，也能抑制合胞体的形成和HIV-1感染的扩散。随着相关实验工作的不断深入，将会有更多的藻类抗病毒药物被逐渐发现并加以利用。

二、活性肽

由于海洋特殊的生态环境，海洋生物产生了比陆生植物次生代谢产物相比更为独特的天然产物。近年来，关于藻类活性肽得到了广泛关注，其生物活性得到进一步研究。特别是经过近几年的研究，藻类中的多种肽类化合物也被证明具有显著的生物活性和药理作用。通过对藻类活性肽氨基酸序列及活性作用的研究，发现具有活性的肽类化合物主要有二肽、环肽和脂肽，这些藻类活性肽化合物主要具有降血压、抗凝血、抗肿瘤、降血脂、抗氧化、抗病毒和促进神经细胞分化等生物活性，根据其生物活性，目前已经开展了相关的化妆品、保健品、药物、生化制品的研究。尽管海岸带藻类生物活性肽的研究历史较短，但因其独特的生物活性作用，已经逐渐成为研究热点（陈志华等，2010）。

1.海藻肽及其结构特征

从海藻中发现和分离，并表明其氨基酸序列的海藻肽不超过100种，典型的有二肽、环肽和脂肽三种。

其中，代表性的二肽有肌肽（carnosine）、爱森藻肽（eisenine）和鹿角菜肽（fastigiata）。肌肽是从海藻中检测出的β-丙氨酸组氨酸，具有抗氧化等特性，对自由基和金属离子引起的脂质氧化具有显著的抑制作用，可以防止肌肤的衰老及肌肤增白的作用，故可以应用在化妆品领域中。爱森藻肽是从褐藻爱森藻（Eiseniabicylis）中分离的一个结晶状肽，其结构式确定为L-吡咯啶酮-L-丙氨酸，该肽具有抗病毒作用和抗过敏活性。鹿角菜肽是Nara等（2005）从鹿角菜和黑角菜等中分离纯化得到的，其结构为L-吡咯烷酮基-α-L-谷酰胺基-L-谷酰胺。经过实验证明，鹿角菜肽对Hela细胞具有抑制作用，对胃肠道蠕动具有刺激作用，同时能够促进消化腺分泌功能。

代表性的环肽有hormothamininA和majusculamide C等。其中hormothaminin A是从一种蓝藻中分离得到的环肽，具有神经毒等活性，其作用机制主要是影响脑垂体细胞静止期的钙离子通道，提高电压敏感性钙离子通道的释放，从而促进脑内激素如催乳素的分泌增加而产生作用。majusculamide C是从蓝藻中分离出的环肽，它对X-5563骨髓癌细胞具有阻断和抑制作用。

代表性的脂肽主要有蓝藻脂肽和hassalLidin A等。蓝藻脂肽是从蓝藻中提取得到的，实验表明具有抗菌杀毒的生物活性。hassalLidin A是Neuhof等（2006）从蓝藻中分离得到的一个具有抗真菌活性的糖基化脂肽。

2.海藻肽的活性作用

海藻肽作为我国重要的药物资源，在《神农本草经》和《本草纲目》中已有悠久的药用历史，海蒿子、海带、昆布和羊栖菜等海藻常用于治疗前列腺增生、淋巴结炎、痛风等，另外还用于治疗甲亢、高脂血症等多种疾病，当今主要针对海藻肽的心血管系统活性作用、神经系统活性作用和抗癌活性作用等方面进行研究。

心血管疾病是威胁人类健康的重要疾病之一，冠心病也被认为与高血脂和凝血等因素有关。目前从马尾藻、海带等褐藻中提取的肽类化合物等藻类活性物质在心血管病防治上发挥了很大的作用。

近几年抗肿瘤活性的藻类多肽也不断被发现，王芳宇等研究了趋化因子受体CCR5亲和短肽（AFDWTFVPSLIL）对肿瘤生成作用的影响。结果显示，短肽能通过诱导人脐静脉血管内皮细胞的凋亡来抑制内皮细胞的生长，并能抑制CAM膜的血管生成。短肽也能在体内抑制小鼠B16黑色素瘤的生长活性，抑瘤率达68.6%。初步证明海藻短肽具有抗肿瘤生成作用，且这种作用可能是通过抑制肿瘤的血管生成来实现的。

生物体内的氧化最终导致生物体的衰老。研究人员从海藻中分离得到多种可清除体内自由基、具有抗氧化作用的活性肽。2005年，Heo等从一种褐藻的5种酶水解产物的提取物中得到了通过活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）和1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）评价的自由基、羟基自由基、超氧阴离子、过氧化氢清除剂的抗氧化水解产物，该水解产物是通过5种碳水化合物水解酶（复合纤维素酶、赛路克雷斯、AMG、耐温淀粉酶和Ultraflo）和5种蛋白酶（复合蛋白酶、酒曲酶、中性蛋白酶、风味蛋白酶和碱性蛋白酶）得到的。

三、海岸带滩涂植物的活性氨基酸及肽

滩涂植物种类丰富，包括翅碱蓬（Suaeda heteroptera）、茵南苜蓿Medicago hispida）、菰（Zizania latifolia）等及陈蒿（Artemisia capillaris）、盐角草（Salicornia europaea）、灰绿藜（Chenopodium glaucum）。其中的活性氨基酸、肽类及肽类衍生物、活性蛋白种类繁多。

1.活性氨基酸

翅碱蓬是广泛分布于我国北方滨海盐碱地的藜科植物。碱蓬资源丰富、容易采集，因它含有氨基酸和维生素，故对其开发利用具有重要价值。翅碱蓬种子和茎叶含有15%～20%的蛋白质，它们都含有18种常见的氨基酸。在种子中占主要成分的是谷氨酸、精氨酸、天冬氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸。特别有意义的是，种子和茎叶中人类营养必需的8种氨基酸含量丰富，基本符合世界卫生组织建议的完全蛋白标准（其中缬氨酸和苯丙氨酸、酪氨酸的含量特别丰富，分别比标准高6.45倍和1.65倍）。翅碱蓬蛋白质是良好的、营养完全的植物蛋白。盐角草又名海蓬子，是有梗无叶的绿色植物，生长期约220d，其中有50～60d可以保持青嫩鲜绿枝茎。海蓬子中富含维生素C，还含有18种氨基酸，是有益人体的绿色保健食品。

红树林（Mangrove）为自然分布于热带、亚热带海岸潮间带的木本植物群落。通常生长在港湾口地区的淤泥质滩上特有的森林，为常绿灌木和小乔木类型。红树林生态系统（Mangrvoe Ecosysetms）处于海洋与陆地的动态交界面，周期性遭受海水浸淹的潮间带环境，使其在结构与功能上具有既不同于陆地生态系统也不同于海洋生态系统的特性。

吕芝香测定了不同培养时期大米草幼苗游离氨基酸均含有天冬氨酸、丝氨酸、谷氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、胱氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、r-氨基丁酸、赖氨酸、组氨酸和精氨酸。其中天冬氨酸、丝氨酸、丙氨酸、缬氨酸、r-氨基丁酸等含量较高，甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、组氨酸和精氨酸等含量较低，谷氨酸、蛋氨酸、酪氦酸和苯丙氨酸等含量更低。在培养过程中，多数氨基酸的含量均有所增加，其中蛋氨酸增加甚少，异亮氨酸、酪氮酸和r-氨基丁酸略有下降。在蒸馏水或海水中，各培养期游离氨基酸种类相同，其含量因氨基酸种类不同而有差异。脯氨酸的含量由于培养条件的不同差异显著。在蒸馏水中培养的幼苗，脯氨酸的含量低，整个培养期含量变化不大，并略有下降的趋势。在海水中培养的，脯氨酸含量均较高，培养7d的，脯氨酸迅速积累，比在蒸馏水的同一培养期的幼苗增加44倍；培养21d的，脯氨酸含量比在蒸馏水中同一培养期的幼苗增加67倍。与培养前幼苗的脯氨酸含量对比，培养7d的，脯氨酸含量增加4.6倍；培养21d的，其含量增加6倍。在海水或蒸馏水中其他各种氨基酸含量虽有差异，但多数的含量基本相近。

2.活性蛋白

翅碱蓬种子和茎叶含有各种分子量的蛋白质约有11种。在种子蛋白质中分子量为5.5万的组分几乎占总蛋白质的50%，分子量为1.7万的占总蛋白质量的13.1%，分子量为3.7万的占总蛋白质的15.5%，其他8种蛋白质共占总蛋白质的21%。茎叶蛋白质的分子量分布与种子蛋白质相似，分子量为5.7万和6.3万两部分占全部蛋白质的65%以上，其次是分子量为3.6万的占14.97%，分子量4.5万的占6.05%，分子量为5.1万的占9.4%，其余蛋白质只占总蛋白质的3.96%。以上的资料说明，种子和茎叶的蛋白质，分子量为5万～ 6万的组分占总蛋白质的50%～60%。这些蛋白质水溶性都很好。种子蛋白质的这种特性很适合作为制造高蛋白质饮料的原料。

三角叶滨藜（Atriplex triangularis）是一种优良耐盐蔬菜作物，蛋白质含量高，脂肪含量低，病虫害少，营养生长期基本不用打农药，具有很高的食用、药用价值，并可在海水灌溉条件下生长。

枸杞（Lycium barbarum L.）属茄科枸杞属，是多年生双子叶落叶灌木，果、叶、果柄和根系中都含有人体需要的蛋白质、维生素、氨基酸和微量元素，是名贵的中药材，声誉享于国内外。

茭白是我国特有蔬菜，品质柔嫩，营养丰富。据分析，100g茭白中含蛋白质1.5g，脂肪0.1g，碳水化合物4g，热量96.1kJ，钙4mg，磷43mg，铁0.3mg，胡萝卜素微量，硫胺素0.04mg，核黄素0.05mg，烟酸0.6mg，抗坏血酸2mg。除食用外，茭白亦可入药。《食疗本草》记载其：利五脏邪气、酒后面赤、目赤、卒心痛、大便不畅、心胸烦热。目前茭白栽培面积较广，从台湾到北京，从舟山群岛至四川盆地都有种植，以江浙的太湖流域栽培最多。茭白是目前浙江省种植面积最大的水生蔬菜，面积达1400hm2。

作为一种谷物，菰含有较多的蛋白质、膳食纤维、钾、磷、钠、镁、镍、钴和硫胺素，水分含量较低。菰米蛋白质中必需氨基酸含量丰富，组成比例合理，它的第一限制氨基酸化学评分是84分，远超过其他谷类和豆类。菰米蛋白质的功效比值为2.75，高于面粉（0.60）、大米（2.18）和大豆（2.32），是优质蛋白质来源。菰草粉是一种良好的饲料，含有较高的蛋白质。