海岸带生物活性物质-甾体化合物

甾体化合物也叫类固醇化合物，广泛存在于动植物组织中，是一类重要的天然产物，其中大多数具有重要的生理作用。这类化合物的分子都具有一个环戊烷多氢菲的基本骨架。除骨架外，绝大多数甾体化合物还含有三个侧链，其中，10位和13位分别是两个甲基，称为角甲基，17位上连有一个较长的侧链，一般还含有官能团（图3-22）。

图3-22　甾体化合物

甾体（steroids）是一类结构非常特殊的天然产物，其分子母体结构中都含有环戊烷多氢菲（cyclopentano-perhydrophenanthrene）碳骨架，此骨架又称甾核（steroid nucleus）。甾体化合物是天然产物中最广泛出现的成分之一，几乎所有生物体自身都能生物合成甾体化合物。天然甾体化合物种类很多、结构复杂、数量庞大、生物活性广泛，是一类重要的天然有机化合物。甾体化合物的提取分离、合成以及应用研究已成为药物开发十分活跃的领域，被称作20世纪研究最为透彻的药物。

甾体类物质在海岸带中分布很广，含量也很高（Kim等，2012）。在海洋无脊椎动物、海绵、肠腔动物、棘皮动物以及海藻中均普遍存在。在陆地植物中，甾体分布面比较窄，如强心苷主要分布在夹竹桃科，麦角甾醇类主要分布在菌类中，植物一般很少。海洋中甾体的类型更为丰富，侧链变化也多；海洋甾体的氧化度更高，经常具有多个羟基或羰基，此外还经常有磺酸基团，使得海洋甾体更具有开发价值；海洋甾体经常和含氮的物质连接，从而构成甾体生物碱。

一、海绵来源的甾体化合物？

从海绵中分离得到的化合物1～6，具有抗肿瘤活性、抑酶活性、抗真菌活性、抗病毒（包括HIV）活性等（El Sayed等，2000）（图3-23）。

图3-23　海绵中分离到的甾体化合物

从海绵中分离得到，双甾体结构，含有4个醚键，具有抗肿瘤活性（El Sayed等，2000）（图3-24）。

图3-24　海绵中分离到的双甾体化合物

南非印度洋的海洋蠕虫体内发现的吡嗪双甾体，具有显著抗肿瘤活性（El Sayed等，2000）（图3-25）。

图3-25　海绵蠕虫体内发现的吡嗪双甾体

从菲律宾海域的海绵Xestospongia sp.中分离得到，具有抗HIV活性（El Sayed等，2000）（图3-26）。

图3-26　从菲律宾海域海绵分离到的甾体化合物

从红海海绵Nephthea.sp.中分离得到，有抗结核作用（El Sayed等，2000）（图3-27）。

图3-27　从红海海绵分离到的甾体化合物

从一种海星Aphelasterias japonica.中发现，具有溶血活性（Finamore等，1992）（图3-28）。

图3-28　从海星中发现的甾体化合物

Tung等（2009）从越南海绵Ianthella sp.的甲醇提取液中分离得到aragusteroketal B（a）和aragusterol B（b），其中化合物a是一种新的C29甾醇，在化合物支链的C25和C26位上有一个环丙烷结构（图3-29）。2种化合物对3种人乳腺癌细胞（MCF-7）、人肝癌细胞（SK-Hep-1）和人宫颈癌细胞（HeLa）均显示出较好的抑制活性，IC50在12.8～27.8　μmol/L之间。

图3-29　甾体化合物aragusteroketal B（a）和aragusterol B（b）

Zhang等（2007）从中国南海海域的海绵Halichondriarugosa的乙醇提取物中得到2个甾体硫酸钠盐24ε，25-dimethyl-3H-hydroxyl-cholest-5-ene-2β-ol sodium sulfate（a）和24ε，25-dimethyl-cholest-5-ene-2β，3α-diol disodium sulfate（b），2种化合物对人肝癌细胞（BEL-7402）、结肠癌细胞（HT-29）、肺腺癌细胞（SPC-A1）和人胶质瘤细胞（U-2514）均显示一定的细胞毒作用，IC50在6.5～23.1μmol/L之间（图3-30）。

图3-30　从海绵提取物中得到的甾体硫酸钠盐

Holland等（2009）从澳大利亚纳尔逊湾的海绵Psammoclema sp.中分离得到4种新的甾体化合物trihydroxysteroid（a～d），4种化合物可有效地抑制结肠癌细胞（HT 29）、乳腺癌细胞（MCF-7）、子宫癌细胞（A 2780）和前列腺癌细胞（DU 145）的生长，IC50在5～27μmol/L之间（图3-31）。

图3-31　从澳大利亚海绵中分离到的甾体化合物

Yang等（2011）从海洋苔藓虫Bugula neritina中分离得到2个氧化甾醇3β，24（S）-di hydroxycholesta-5，25-dien-7-one（a）和3β，25-dihydroxycholesta-5，23-dien-7-one（b），2种化合物对肝癌细胞（HepG2）、结肠癌细胞（HT-29）和大细胞肺癌细胞（NCIH4603）均具有细胞毒作用，IC50在22.58～53.41μg/ml之间（图3-32）。

图3-32　从海绿苔藓虫分离到的氧化甾醇

Cui等（2010）从褐藻Sargassum kjellmanianum分离得到的内生真菌Aspergillus ochra ceus EN-31中分离得到3种新的甾体化合物7-Nor-ergosterolide（a），3β，11α-dihy drox yer gosta-8，24（28）-dien-7-one（b）和3β-hydroxyergosta-8，24（28）-dien-7-one（c）。化合物（a）是一种罕见的在B环上含有一个内酯的7位去甲甾类化合物，对非小细胞肺癌（NCl-H460）、人肝癌细胞（SMMC-7721）和人胰腺癌细胞（SW1990）均显示出细胞毒作用，IC50分别为5.0μg/ml、7.0μg/ml和28.0μg/ml；化合物（b）对SMMC-7721显示出细胞毒作用，IC50为28.0μg/ml（图3-33）。

图3-33　从褐藻中分离到的甾体化合物

Simmons等（2011）从海绵分离得到的放线菌Actinomadura sp.SBMs009的乙酸乙酯提取液中得到化合物bendigoles（a）～（c），3种化合物均表现出一定的抗炎活性，都能抑制糖皮质激素受体（GR）易位活性，其中化合物（a）的抑制效果最佳；化合物（c）还可有效抑制NF-κB核易位活性，IC50为70μmol/L（图3-34）。

图3-34　从海绵分离到的放线菌提取液得到的化合物

Mandeau等（2005）从瓦努阿图拉门湾海绵Euryspongia n.sp.的乙醇浸提液中分离得到化合物3β-hydroxy-24-norchol-5-en-23-oicacid（a）和3β-hydroxy-26-norcampest-5-en-25-oic acid（b），2个化合物对卡西霉素（A23187）诱导下角朊细胞（HaCaT）的6-酮前列腺素的产生具有一定的抑制作用，其中化合物（b）在浓度0.1μg/ml，1.0μg/ml和10.0μg/ml时，6KPGF1含量分别为24%，31%和41%（图3-35）。

图3-35　从海绵的乙醇提取液中分离到的化合物

Wei等（2007）从加勒比海海绵Svenzeazeai的乙醇-氯仿提取液中分离得到具有［6-5-6-5］-甾核结构的新型化合物abeo-sterols parguesteros，2种化合物可有效地抑制结核菌Mycobacterium tuberculosis H37R v的活性，最低抑菌浓度（MIC）分别为7.8μg/ml和11.2μg/ml（图3-36）。

图3-36　从海绵乙醇一氯仿提取液分离到的化合物

Boonlarppradab等（2007）从帕劳群岛采集到未鉴定的Euryspongia属海绵中分离获得2个硫酸甾体eurysterols，2个化合物对两性霉素B耐药的野生白色念珠菌Candida albicans表现出抑菌活性，MIC值分别为15.6μg/ml和62.5μg/ml（图3-37）。

图3-37　从海绵中分离到的硫酸甾体

Gong等（2013）从中国南海软珊瑚Sarcophyton sp.的甲醇提取液中分离得到的2种化合物可有效抑制甲型H1N1流感病毒的活性，IC50分别为19.6μg/ml和36.7μg/ml（图3-38）。

图3-38　从南海软珊瑚的甲醇提取液中分离到的化合物

Chen等（2011）从台湾珊瑚I.hippuris的丙酮提取液中分离得到2个多羟基甾醇（a）和（b），经细胞病变抑制试验发现，该化合物可有效阻遏人巨细胞病毒（HCMV）感染人胚胎成纤维细胞（HEL），EC50分别为2.0μg/ml和6.0μg/ml。与此同时，其对HEL细胞未显示细胞毒活性（图3-39）。

图3-39　从台湾珊瑚的丙酮提取液中分离到的多羟基甾醇

Rudi等（2001）从红海海绵Clathria sp.的甲醇-乙酸乙酯提取液中分离得到如下化合物，在浓度为10μg/ml时，该化合物可有效抑制人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）反转录酶的活性（图3-40）。

图3-40　从红海海绵的甲醇—乙酸乙酯提取液中分离到的化合物(www.xing528.com)

Whitson等（2008）从菲律宾群岛海绵Spheciospongia sp.的甲醇提取液中分离得到4种化合物（a）～（b），4种化合物均可有效抑制蛋白激酶C的活性，IC50分别为1.59mol/L，0.53mol/L，0.11mol/L和1.21mol/L。进一步研究发现，其对NF-κB也有抑制活性，EC50在12～64μmol/L之间（图3-41）。

图3-41　从海绵的甲醇提取液中分离到的化合物

Dai等（2010）从印度尼西亚海绵Topsentia sp.的甲醇提取液中分离得到5种化合物，其中化合物（a）（图3-42）具有显著的天冬氨酸蛋白酶（BACE1）的抑制活性，IC50为2μmol/L。其他4种化合物对BACE1均不具有抑制作用，这可能与其存在硫酸酯钠基团有关。

图3-42　从印度尼西亚海绵的甲醇提取液中分离得到的化合物

Rao等（2010）从印度马纳尔湾海绵Callyspongia fibrosa分离得到化合物（a）～（b），研究发现这些化合物对恶性疟原虫（Plasmodiumfa lciparum）均有中等抑制活性，其中化合物（a）的效果最佳，而与氯喹相反，其对恶性疟原虫氯喹抗药株的活性要比氯喹敏感株的活性好（图3-43）。

图3-43　从印度海绵分离到的化合物

二、海星来源的甾体化合物

广义海星皂苷指的是从海星中分离得到的以甾体为母核的配糖体。狭义海星皂苷是指具有△9，113β，6α-二羟基甾体母核，并在3位硫酸化、6位糖基化的一类特定的大分子甾体化合物。按结构可分为多羟基甾醇及其糖苷、环式甾体皂苷以及海星皂苷。

1.多羟基甾醇及其糖苷

Wang等（2005）从韩国海星Certonardoa semiregularis的甲醇提取液中分离得到硫酸酯化甾体皂苷化合物（a）和（b），化合物（a）对肺癌细胞（A549）、卵巢癌细胞（SKOV-3）、皮肤癌细胞（SK-MEL-2）、XF498和人结直肠腺癌细胞（HCT15）具有一定的抑制活性，其中对SK-MEL-2的抑制效果最好，ED50为2.67μg/ml（图3-44）。

图3-44　海星来源的多羟基醇及其糖苷

Kicha等（2008）从远东海星Hippasteria kurilensis的乙醇提取液中分离得到6种化合物（a）～（f），化合物（b）（c）（d）（f）分别在浓度5.5×10-5，5.5×10-5，6.7×10-5和1.3×10-5mol/L的条件下，对紫海胆Strongylocentrotus nudus卵受精的抑制作用达100%，化合物（a）和（e）在5×10-5mol/L的浓度下显示出弱的抑制活性（图3-45）。

图3-45　从远东海星的乙醇提取物中分离到的化合物

2.环式甾体皂苷

不含硫酸基，但含1分子葡萄糖醛酸（连接于苷元3位），△7-3β，6β-二羟基甾体母核，寡糖基由3个单糖基组成，第3个糖基的6位羟基与苷元6位成苷，组成环状结构，状若环醚（图3-46）（马宁，2009）。

图3-46　环式甾体皂苷的结构

3.海星皂苷

（1）海星皂苷的化学性质：当一个非糖类物质（如三萜、甾体、二萜）连接糖以后所形成的物质称之为苷，这时把非糖类物质称为苷的苷元。海星皂苷极性大，不易结晶，因而大多数为无色不定型粉末，可溶于水，易溶于热水、稀醇、热甲醇和热乙醇中，含水丁醇或戊醇对皂苷的溶解度较好。几乎不溶或难溶于乙醚、苯等极性小的有机溶剂。海星皂苷具有溶血作用，大多数海星皂苷的水溶液有溶血作用，这可能是海星的一种自我保护机制；沉淀反应，海星皂苷的水溶液可以和铅盐、钡盐、铜盐等产生沉淀，利用这一性质进行皂苷的提取和初步分离；化学定性显色反应，Lieberman-Burchard反应，用于鉴别甾体母体；Molish反应（萘酚、浓硫酸），用于鉴别甾体连接的糖。

除3位硫酸基外，甾体母核、侧链和糖基上均无其他硫酸基团；侧链至少有1个位置被氧化，如羟基、酮羰基或环氧基团，甾体母核除3，6位外一般无含氧基团；苷元的侧链一般由8个碳原子骨架组成，一些化合物有失碳现象，碳原子可少至2个，另有一些在C-24位连接有额外的1或2个碳原子；糖基的个数以5或6个的情况居多，常见糖的种类为喹诺糖（quinovose，Qui）、岩藻糖（D-fucose，Fuc）、木糖（D-xylose，Xy1）、半乳糖（D-galactose，Gal）、葡萄糖（D-glucose，Glc），少见的有阿拉伯糖（L-arabinose，Ara）、D-6-去氧-木-4-己酮糖。所有糖基几乎均以吡喃形式存在。除阿拉伯糖为α构型外，其余糖基的苷键构型均为β；寡糖链具有相似的连接方式，多具1个分支，少数具有2个分支或无分支。起始糖基多为喹诺糖或葡萄糖。除个别例外（如santiagoside），每一位置上糖基的苷化位置基本固定（图3-47）。

图3-47　海星皂苷

（2）海星皂苷的提取与分离：由于海星体内的酶容易水解海星皂苷，因此提取时首先要抑制酶的作用。一般可用乙醇破坏酶的活力，或用硫酸铵等无机盐盐析，使酶沉淀除去。

①总皂苷的提取：

1）两相萃取法：减压浓缩所得提取液，再用氯仿或乙酸乙酯与水分配，除去脂溶性成分，最后用水饱和的正丁醇与水分配，浓缩所得的正丁醇溶液即得总皂苷（康俊霞等，2012）。

2）铅盐法：滤液先用乙醚除去其中的叶绿素和油脂等杂质，然后加饱和乙酸铅水溶液至不再产生沉淀为止。过滤，滤渣加适量乙醇使成50%的浓度，按常法用饱和硫酸钠水溶液、稀硫酸，或通硫化氢脱铅，过滤。

3）吸附法：滤液用新煅烧的氧化镁或活性炭吸附，再用甲醇或其他适当溶剂解析，浓缩即得总苷。有时先用铅盐法或溶剂法处理后，再用吸附剂吸附纯化。

②皂苷的纯化：将上述方法获得的总皂苷部位溶于水，上样至大孔吸附树脂柱，先用水洗去糖及蛋白质等成分，然后用梯度甲醇或乙醇洗脱，可获得更为精制的总皂苷。

硅胶色谱和反相硅胶色谱（键和C-18反相硅胶）纯化，具有上样量大、操作简单等优点，分离效果差，易吸附皂苷，在用硅胶色谱分离皂苷类化合物时，经常采用氯仿-甲醇-水三元溶剂系统。显示剂采用硫酸-乙醇溶液或硫酸-香兰素（在氯仿-甲醇溶剂系统中加入适量的水，可克服皂苷类化合物进行硅胶色谱时产生的脱尾现象，获得更好的分离效果）。

反相硅胶色谱（键和C-18反相硅胶）的优点：分离效果好，样品回收率高；缺点：上样小，不容易实现工业化生产；固定相为十八烷基键合硅胶；最常用溶剂为水、甲醇、乙腈和乙醇（赵君等，2013；樊廷俊等，2008）。

三、珊瑚来源的甾体化合物

Zhang等（2013）从中国南海海域的偏扁软柳珊瑚Subergorgia suberosa中分离得到新的9，11-开环甾醇化合物subergorgols（a）（b），2个化合物具有特征的3，6，11- trihydroxy-7-en-9-one-5-9，11-secosteroid母核，化合物（a）对人白血病细胞株K 562及人乳腺癌细胞株MDA-MB-231有较强的抑制活性，IC50分别为5.5μmol/L 和6.2μmol/L。化合物（b）对K 562细胞株也有很好的抑制作用，IC50为6.5μmol/L（图3-48）。

图3-47　从偏扁软柳珊瑚中分离到的甾醇化合物

Lai等（2011）从中国广西北部湾的柳珊瑚Astrogorgia sp.中分离得到5种9-10开环甾醇化合物（a）～（e），结构特点是在9-10开环母核上都含有一个3-hydroxy-10-methylphenyl环，这类化合物对与肿瘤相关的间变性淋巴瘤激酶（ALK）、酪氨酸激酶（AXL）、黏着斑激酶（FAK）、胰岛素样生长因子受体（IGF-1R）、SRC激酶和血管内皮生长因子受体2（VEGF-R2）均具有特异性抑制作用（图3-49）。

图3-48　从北部湾柳珊瑚中分离到的甾醇化合物

Quang等（2011）从越南软珊瑚Lobophytum laevigatum的甲醇提取液中分离到新的甾体类化合物lobophytosterol，在C17和C20位上存在一个环氧结构，对人结肠癌细胞株（HCT-116）、肺癌细胞株（A549）和人早幼粒白血病细胞株（HL-60）均有细胞毒活性，IC50分别为3.2μmol/L，4.5μmol/L和5.6μmol/L，主要是通过诱导细胞凋亡的方式来抑制细胞的增长（图3-50）。

图3-50　从越南软珊瑚的甲醇提取液中分离到的甾体类化合物

Huang等（2008）从台湾软珊瑚Nephthea chabroli的丙酮提取液中分离得到6个甾体化合物（a）～（f），并进行体外抗炎活性测试。结果表明，化合物（c）（d）（e）在浓度为10μmol/L时，能够分别有效地降低iNOS的量至0，43.1%±7.9%和76.9%±9.4%；化合物（a）～（c）和（f）也均可显著地抑制iNOS的表达（10.6%±0.5%，9.6%±1.0%，0和32.8%±6.8%），但是不能抑制COX-2蛋白表达（图3-51）。

图3-51　从台湾软珊瑚的丙酮提取液中分离到的甾体化合物

Cheng等（2009）从台湾软珊瑚Nephthea chabroli的丙酮提取液中分离得到C19位氧化的化合物nebrosteroids（a）～（d）和4-甲基化的化合物nebrosteroid（e），经脂多糖（LPS）诱导对巨噬细胞R AW264.7进行体外抗炎活性测定。结果表明，化合物（a）（b）（d）和（e）在浓度为10μmol/L时，能够将iNOS的量分别减少至20.2%±2.6%，65.2%±5.5%，79.2%±11.3%和61.0%±4.6%，将COX-2的量分别降低至75.3%± 3.3%，86.0%±1.7%，63.8%±7.7%和60.1%±4.6%；化合物（c）对iNOS和COX-2均没有抑制作用（图3-52）。

图3-52　从台湾软珊瑚的丙酮提取液中分离到的化合物

Su等（2008）从台湾软珊瑚Sinularia sp.和八放珊瑚Dendroneph thyagriffini的乙醇提取液中分离得到8个含有2个羟基的甾体化合物（a）～（h），其中化合物（a）和（b）在甾核C9和C11位存在一个双键。经体外抗炎活性测定，发现化合物（a）（b）（g）在浓度为10μmol/L时，对LPS诱导下的巨噬细胞R AW264.7的促炎COX-2蛋白的积累具有一定的抑制作用。化合物（e）～（h）在浓度为10μmol/L时，对LPS诱导下的巨噬细胞R AW264.7的促炎iNOS蛋白的积累具有较好的抑制作用（图3-53）。

图3-53　从珊瑚的乙醇提取液中分离到的甾体化合物

四、海岸带来源甾体化合物的分离纯化

甾体化合物是以环戊烷多氢菲为母核的结构，因而绝大多数的甾体化合物极性都较低。目前，通常采用不同极性的有机溶剂对海洋来源样品进行浸提，减压浓缩，得到粗浸膏，然后再运用硅胶、凝胶和反相高效液相等色谱方法对粗分样品进行分离纯化。

五、海岸带来源甾体化合物的应用前景

海岸带来源甾体化合物具有抗肿瘤、抗菌、抗炎和抗病毒等生理活性，具有良好的新药开发前景。不同生物来源的甾体化合物在结构上有所差别，甾核环或支链上的细微差别都可能引起生理活性的显著差别。甾体化合物的应用非常广泛，如治疗过敏性疾病的氢化可的松、避孕药黄体酮、利尿剂安体舒通、合成甾体激素的薯蓣皂甙元、强心作用的地高辛、蟾毒甙等都是甾体化合物。

因此，可以以这些天然甾体化合物作为药物研究的先导化合物，研究其在体内的吸收、分布、代谢、排泄和毒性，进一步进行构效关系和化学合成研究，开发生理活性显著的甾体化合物并进行药物设计和制备，为人类健康做出贡献。