海岸带生物活性物质中的多不饱和脂肪酸

多不饱和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids，PUFAs）是指含有两个或更多个不饱和双键结构的脂肪酸，又称多烯脂肪酸。基于第一个不饱和键位置不同，PUFAs可分为ω-3，ω-6，ω-7和ω-9等系列（即ω编号系统，也叫n编号系统）（孙翔宇等，2012）。距羧基最远端的双键在倒数第3个碳原子上的称为ω-3系列，包括α-亚麻酸（ALA）、二十碳五烯酸（EPA）、二十二碳五烯酸（DPA）和二十二碳六烯酸（DHA）等；在第6个碳原子上的称为ω-6系列，包括亚油酸（LA）、二高-γ-亚麻酸（DHGLA）、γ-亚麻酸（GLA）和花生四烯酸（AA）等；此外还有ω-7系列、ω-9系列（二十碳三烯酸，Mead acid）等。ω-3和ω-6系列PUFAs具有重要生物的生物活性且与人类的健康息息相关，很多情况下，ω-3和ω-6系列PUFAs在功能行使上相互制约和相互促进，共同调节生物体的生理功能。研究发现，ω-3PUFA具有抗心律失常的作用（鲍建民，2006）。大量流行病学调查显示，爱斯基摩人冠心病死亡率只有31.5%，而年龄相当的丹麦人或北美人心肌梗死的死亡率要高很多，这是因为爱斯基摩人常食鱼类、海兽或鱼油，其中ω-3多不饱和脂肪酸占脂肪酸摄入量的13.11%，而丹麦人或北美人食物中ω-3多不饱和脂肪酸却只有0.18%。随着饮食中ω-3PUFA含量在合理范围内增加，心脏病发生率呈现降低趋势（马立红等，2006）。

关于ω-6和ω-3的研究表明，脑、视网膜中两种主要的多不饱和脂肪酸为花生四烯酸和DHA，对其发育有着直接的影响。大量研究证实，ω-3族的多不饱和脂肪酸表现出的促生长作用较弱，但对脑、视网膜、皮肤和肾的发育及功能的完善十分重要，比较典型的是DHA（杨贤庆等，2014）。

AA，ALA，EPA和DHA在人体内不能合成，需要从食物中摄取，称为人类的必需脂肪酸。本节主要介绍多不饱和脂肪酸的来源、生物活性及其应用的研究进展。

一、二十二碳六烯酸（DHA）

（一）DHA的结构及其功能

二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid）简称DHA，系统全名为全顺式-4，7，10，13，16，19-二十二碳六烯酸，是一种含有6个双键的22碳长链多不饱和脂肪酸，相对分子量为328.49，分子式为C22H32O2，结构式如图3-1（曹万新等，2011）。

图3-1　DHA化学结构式

从碳氢链甲基端碳原子开始，第一个双键位于第三个碳原子处，因此DHA属于ω-3系列不饱和脂肪酸。DHA分子结构中的6个不饱和双键使其具有较低的熔点和较高的流动性，因而常温下纯净的DHA为浅黄色或无色的澄清油状液体。DHA无色无味，不溶于水，易溶于乙醇，能与氯仿、乙醚以及石油醚等有机溶剂任意比互溶且具有脂溶性，是典型的含有多个“戊烯双键”结构（即隔离双键）的多不饱和脂肪酸。由于DHA含有5个活泼的亚甲基和6个双键，其化学性质较为活泼，极易受氧、光照、过热、金属离子（如Fe2+，Cu2+的催化作用）和自由基的影响，发生氧化、聚合、酸败、双键共轭等化学反应，生成醛、酸、酮醇、羰基化合物等一些挥发性和非挥发性物质，需要低温绝氧保存（朱丽娜等，2009）。

DHA属于多不饱和脂肪酸，与我们身体健康有密切关系，是婴幼儿健康成长过程中不可或缺的营养因子，同时对防治心脑血管疾病和抗癌也有很好的功效。DHA还可以抑制细胞增殖、转移，抑制细胞内信号传导途径，诱导其分化、凋亡，改善肿瘤患者的体质，提高患者的存活率，对多种癌细胞发挥抑制效应（曹万新等，2011）。

人及其他高等生物自身不能合成DHA，而微藻、海洋真菌等低等生物则具有合成DHA的能力，这些低等生物也是DHA的原始生产者，而那些依靠食物链吞食藻类及其他微生物而积累DHA的常见于海岸带动物等高等生物。传统的DHA主要来源于鱼油，该类型产品不但成本高昂，而且有鱼腥味，来源也不稳定，所以从海岸带微生物来获取DHA成为必然趋势，也成为研究的热点。

（二）DHA的传统来源

目前，DHA主要来源于脂肪含量高的海洋鱼类，生活在深海和寒冷地区的海洋鱼类含量尤为丰富，可达到20%～30%。但是，利用鱼油生产DHA存在许多缺点（张义明，2003）。

（三）DHA的非传统来源

作为食物链中的初级生产者，海岸带微生物是DHA的原始生产者，寻找可高效生产DHA的海洋微生物生产已成为共识。在已探究到的部分海岸带微生物中，尤其是在藻类、真菌和细菌中，ω-3多不饱和脂肪酸不但结构和生物活性具有多样性，而且其相对含量远高于鱼油中的含量。DHA含量丰富的微生物多集中于海岸带金藻、甲藻、隐藻、硅藻以及海岸带真菌中的破囊壶菌和裂殖壶菌中（表3-1）。

表3-1　产DHA微藻的种类

（续表）

1.细菌

研究证实，在深海和深海沉积物中存在具有DHA生产能力的细菌，但这些细菌大部分生活在低温和高压环境下，不适宜在实际生产中应用（江黎明，2007）。

2.微藻

研究表明，大约有500种海岸带微藻具有生产DHA的潜力，得到证实的至少有88种，包括硅藻类、甲藻类、隐藻类等较低级真菌中的藻状菌。利用微藻生产制备DHA具有以下优点：操作相对比较简单，高密度培养易于实现，产量和质量在一定范围内可控，具有工业化生产DHA的巨大潜力。但也存在突出的问题：部分微藻获得比较困难，大部分微藻生产周期相对较长，无法获得纯种藻株，污染问题突出，产品得率相对较低，所以在商业化道路上有待进一步开发（温雪馨等，2010；陈殊贤等，2013）。

3.海岸带真菌

目前发现产DHA的海岸带真菌主要是一些较低级的藻状菌类，其中破囊壶菌（Thraustochytrium roseum）和裂殖壶菌（Schizochytrium）是研究最多、最有潜力成为DHA生产菌株的两种海岸带真菌，特别是破囊壶菌，具有7个属，42个菌种能够产DHA（吴克刚等，2003；李晶晶等，2013）。破囊壶菌和裂殖壶菌均是在海岸带分离获得，是有色素和具光刺激生长特性的海洋真菌。在分类学上，二者同属于真菌门（Eumycota）、卵菌纲（Oomycetes）、水霉目（Saprolegniales）、破囊壶菌科（Thraustochytriaceae）。两者的主要区别在于裂殖壶菌的营养细胞能够通过连续的二均分裂进行快速增殖。破囊壶菌的菌体类似于单中心的壶菌，但形状和大小不同，营养体生长到一定阶段会形成假根或外质网，继而形成孢子囊，孢子囊发育成熟后破裂释放出游动孢子；裂殖壶菌可以同时依靠连续的二均分裂增殖和形成可释放游动孢子的孢子囊进行繁殖。两者在生长过程中，菌体容易聚集形成大的菌落或聚集体，裂殖壶菌尤为显著，在培养基中用Na2SO4代替NaCl能够有效地抑制这种聚集作用（周立树 ，2014）。

裂殖壶菌是一类属于真菌门、卵菌纲、水霉目、破囊壶菌科的海岸带真菌，单细胞，球形。学者已成功从自然界中分离出5个种，分别是S.aggregatum，S.limacinum，S.mangrovei，S.minutum和S.octosporum。其中，S.limacinum是Nakahara在太平洋沿岸海域分离获得，胞内油脂占生物量的70%以上，约90%以人体容易吸收的甘油三酯（TG）的形式存在，少量以卵磷脂（PC）的形式存在；不饱和脂肪酸含量极为丰富，主要为ω-3和ω-6系列不饱和脂肪酸，其中DHA占总脂肪酸的质量分数高达35%～45%。此外，该菌株细胞中还富含类胡萝卜素、虾青素、角鲨烯等对人类有益的活性物质。与破囊壶菌等其他海洋真菌相比，裂殖壶菌具有更好的菌体生长优势和更高的DHA含量，市场前景更为广阔（李晶晶等，2013）。

（四）DHA的应用开发

随着人们对DHA生理作用认识的加强，利用微生物发酵生产DHA已成为研究学者关注的热点（曹万新等，2011）。国外对裂殖壶菌发酵DHA研究较早，部分国家和地区已进入大规模工业化生产和商业化阶段。最著名的案例是，1991年，美国Omega公司首次将裂殖壶菌应用于商业生产，48h的培养结束后，生物量能达到20g/L，DHA占干重的10%。经过数十年的高产优势菌株筛选以及培养条件的不断优化，Omega公司使DHA产量提高到了40～45g/L，处于国际领先水平。Nakahara等分离得到的一株高浓度葡萄糖耐受性菌株Schizochytrium sp.SR 21，经过56h培养，生物量可达到21g/L，DHA产量达到4.7g/L，后经优化上罐发酵120h后，生物量和DHA产量分别达到59.2g/L和15.5g/L。Jakobsen等在油脂积累阶段限制N、P和溶氧，生物量达到90～100g/L，DHA占脂肪酸含量由36%提升到52%。

近年来，国内越来越多的科研机构投入到裂殖壶菌发酵生产DHA的研究中，虽取得了一定程度的进步，但在DHA产量和质量上都较国外有很大差距。其中，南京工业大学利用1500L发酵罐培养Schizochytrium limacinum HX-308，采用分阶段溶氧调控手段调控发酵过程，DHA产量高达37.75g/L，在国内处于领先水平。

二、二十碳五烯酸（EPA）

（一）EPA的生理功能

EPA属于ω-3多不饱和脂肪酸（polyunsaturated fatty acid，PUFA），是一种在人体内难以合成的必需脂肪酸，需从食物中获取。EPA在营养和医学上的重要作用，已引起人们广泛关注（石雨等，2014）。EPA与人体的生命活动以及生理功能密切相关，其主要生理功能包括抗炎作用，抗癌作用，防动脉硬化，降血脂，健脑明目，抗血小板聚集，预防心肌梗死、脑梗死等心脑血管疾病。

在水产养殖中，EPA在饲料中的添加也是必不可少的（马晶晶等，2014）。作为双壳类幼虫、对虾幼体、鱼类幼体等的必需脂肪酸，EPA对其生长发育和存活起到了关键性的作用。EPA对有些动物虽然不是必需的，但在其饵料中适当添加，动物的生长速率和存活率也可以得到较大提高。

图3-2　EPA化学结构式

（二）EPA的生物来源

深海鱼油是目前市场上EPA的主要来源，但来源于鱼油中的EPA具有以下缺点：腥味问题，高胆固醇，鱼油资源有限，稳定性差，易发生氧化，成本相对较高，且随着鱼的品种、季节、地理位置等的不同而EPA含量有所变化，因此以鱼油作为EPA来源的不稳定性和存在的问题显而易见。而且，由于环境污染导致的海鱼脂肪中积累的大量持续性有机污染物，对人体的健康也存在较大的威胁。研究表明，鱼油中的EPA并不是鱼类本身合成的，而是来源于食物，通过积累产生的，因此依靠海洋鱼油生产EPA已远远不能满足社会的需要。海岸带微藻也是鱼类摄取的主要食物，这些海岸带微藻本身具有合成EPA的能力，EPA含量非常丰富。而且与鱼油相比，海岸带微藻油脂中不含胆固醇，脂肪酸组成更稳定，也没有鱼油中存在的一系列缺点，同时相对于鱼类来说，微藻具有生长周期短、产量高、占地面积少、易于实现大规模人工培养等优点，此外还可通过分子生物学的改造和培养条件的控制来提高微藻EPA的含量。因此，海岸带微藻在生产EPA上具有巨大的潜力（曾名勇，1995）。

微生物中也含有EPA，以真菌最为常见。研究发现，能生产EPA的真菌主要是低等真菌，如腐霉（Pythium）、水霉（Saprolegnia）、被孢霉（Mortierella）等。此外，酵母和细菌亦含有一定量的EPA。

早在20世纪50年代，微藻的脂肪酸组成就得到了系统的研究。迄今，已有上百种微藻的脂肪酸组成被测定，主要有甲藻类、硅藻类、绿藻类、金藻类、黄藻类、蓝藻类、隐藻类和红藻类。其中研究最多的是小球藻、微绿球藻、中肋骨条藻、三角褐指藻、新月菱形藻（Nitzschia closterium）、等鞭金藻（Isochrysis galbana）等。其中EPA含量较高的是Monodus subterraneus（34.2%）、Chorella minutissima（31.3%）、三角褐指藻（21.4%）。

（三）不同的培养条件对微藻EPA含量的影响

1.培养基的化学组成

在自养培养过程中，氮、磷、铁、硅、维生素等都会影响微藻的EPA含量。氮元素影响最为显著，其种类和浓度都会影响微藻EPA含量。以三角褐指藻作为研究对象发现，分别利用氯化铵、硝酸钾和尿素作为氮源时，EPA含量分别为10.1%、25.2%、21.8%。研究发现，随着氮浓度的增加，EPA产量呈增长趋势，可能是由于细胞平均分裂速度不断增强所致。磷含量对微藻EPA含量也有重要影响。在缺少磷元素的条件下，三角褐指藻的EPA含量随磷浓度的降低从21.41%降至15.64%。在铁浓度为24.5　μmol/L时，三角褐指藻的EPA含量最高，当低于24.5μmol/L或高于24.5μmol/L 时EPA含量均开始降低。硅不足时会促使脂肪酸在藻类中积累，维生素也可促进微藻生长，进而提高EPA产量（马国红等，2015）。

2.温度、光照强度和盐度

大量研究表明，温度是微藻EPA含量影响的显著因素之一，但也因种而异。当温度在10～30℃之间时，20℃为新月菱形藻合成EPA的最佳温度，EPA含量与温度呈显著的负相关。在温度15～30℃之间，温度对球等鞭金藻的EPA含量无显著影响。另一个显著影响微藻EPA含量的因素是光照强度。大多数藻类在低光强下EPA含量较高，如小球藻C97和C102，微绿球藻及简单角毛藻（Chaetoceros simplex）。还有一些藻类趋势相反，如紫球藻（Porphyridium cruentum）EPA含量随光强的增强而增加。盐度对微藻EPA含量的影响因种而异，如4株小球藻的EPA含量随盐度的增加而减少。盐度对绿色巴夫藻（Pavlova virds）的EPA含量无显著影响（李卓佳等，2008；蔡敬等，2016）。

3.生长期

微藻的生长可分为延缓期、指数生长期、相对数生长下降期、静止期（稳定期）。微藻细胞在不同的生长时期，EPA含量有所不同，并且生长期对微藻EPA含量的影响也因藻种而异。微绿球藻随培养时间的延长，EPA含量从22.5%降至16.8%。三角褐指藻在静止期时，EPA含量达到最大。

4.通气量和pH

PUFA合成中去不饱和过程需要分子氧，因此通气量对微藻EPA含量有一定的影响。高通气量利于纤细角毛藻（Chaetoceros gracilis）EPA的积累。通气量对Nannochloropsis sp.的EPA积累影响显著。pH能改变细胞内相关酶的活性和结构状态、金属复合物的溶解度等，进而影响微藻脂肪酸的含量。在起始pH为6.5～9.0范围内，后棘藻（Ellipsoidion sp.）的EPA含量在起始pH7.5时最高。在pH为6.2～9.8范围内，微绿球藻的EPA含量在pH6.8时较高，在pH9.8时最低（张秋红，2014；吴华莲等，2014；杨秀艳，2013）。

5.自养和异养

研究表明，某些微藻通过异养可提高EPA含量。通过对海岸带硅藻Nitzschia laevis分别进行自养和异养培养，发现异养下的EPA含量（23.2%）要高于自养下的EPA含量（16.7%）。异养条件下的雨生红球藻虾青素的产量也高于自养培养，因此可在微藻培养基中加入有机碳源进行异养培养以生产EPA。

（四）利用微藻生产EPA的现状及前景

研究表明，藻类生产EPA的产率比细菌和真菌高出1～2个数量级。利用微藻生产EPA主要通过以下三种形式实现（王曰杰等，2015；陈智杰等，2012）：

1.密闭式光生物反应器培养

密闭式光生物反应器可实现高效、高密度及高产的培养，但是在利用密闭式光生物反应器进行微藻自养培养的过程中也面临以下几个问题：微藻很容易在内壁附着；通气量太大以及氧气的积累，导致不饱和脂肪酸含量降低；随着培养的推进，微藻密度不断增高，导致光吸收和利用率下降，产量降低。

2.开放式大池培养

此种培养方式传统、简单，生产成本最低，有很多企业仍在使用，不足之处是对养殖地的光照和温度要求较高，而且温度很难准确控制，水分散失严重，污染问题较难解决。

3.异养培养

微藻异养培养中，不需要光照，把有机碳源作为唯一碳源和能源。但是，能够进行异养培养的藻种必须满足以下条件：生命力强，可适应新环境；在缺少光照的条件下进行分裂和代谢；能够在价格低廉的培养基中成活；能够承受循环水水压。

利用微藻生产EPA的首要任务是筛选能够异养生长的微藻，优化出合适的培养条件和方法，不断完善提取工艺，从而实现EPA的大规模生产。据报道，美国的Martek公司利用Nitzschia alba来生产EPA，产量可达到0.25g/（L·d）。

（五）海岸带微藻诱变育种的研究进展

大多数生产公司采用的藻种多从自然界中直接分离获得，性状单一，长时间培养易出现退化等问题，限制了微藻的商业化开发。因此，采用育种技术改良微藻品种，以期获得生物活性物质产量高的藻种，已成为新的研究热点。目前藻种的改良一般借鉴农作物育种中常采用的诱变技术进行，使细胞核染色体发生畸变，碱基突变、缺失、置换、基因重组等生物学效应，使后代性状发生改变。诱变育种技术主要有物理、化学、生物等方法，其中化学诱变方法主要采用甲基磺酸乙酯、亚硝基胍、叠氮化钠、平阳霉素等诱变剂进行育种；物理诱变手段主要采用射线辐照、激光、离子束等方法；生物方法有细胞融合、转基因等。

1.物理诱变育种

常用的物理诱变辐射源有紫外线、倍频Nd∶YAG激光、He-Ne激光、半导体激光、

60Co-γ射线、超声波等（庄惠如等，2001；田燕，2008；马超，2014；杨闯，2010；赵爱娟，2005；叶丽，2014）。

（1）紫外线诱变育种：紫外辐射对陆生生物及浮游植物的生长有毒害作用，尤其是在基因、生理结构及光合作用等方面。但有文献报道，中波长的紫外辐射对微藻营养物质的吸收、光合作用、细胞分裂及不饱和脂肪酸的含量有一定的促进作用。研究表明，三角褐指藻通过紫外辐射能显著提高不饱和脂肪酸的含量，尤其是EPA的含量。周玉娇等采用紫外线对小球藻Y019进行诱变，筛选获得M37和M67两个高含油量株系，油脂含量分别提高了24.58%，17.88%。张学成等采用紫外线诱变小球藻，筛选得到突变株M51，M59，M73，生长速率比出发藻株分别提高了6.23%，3.8%，5.92%，蛋白含量提高约2.5%。

（2）激光诱变育种：激光作为一种育种手段，具有简单、方便和安全等优点，在工业微生物育种中取得了不少进展。赵萌萌等用不同剂量的He-Ne激光照射钝顶螺旋藻，获得的藻体在形态、蛋白质、胞外多糖和β-胡萝卜素等方面均发生了不同程度的变化，其中β-胡萝卜素含量增幅高达18.1%。庄惠如等采用紫外激光复合诱变雨生红球藻，诱变后藻细胞的生长速率提高11.1%，虾青素积累量提高了52.2%。

（3）射线诱变育种：常用的射线有X射线、γ射线、中子束、电子束等，这些射线可以引起DNA链断裂，当不能修复到原状时就会出现突变。在微藻育种中常用的射线是60Co-γ射线，汪志平等用EMS和60Co-γ射线处理钝顶螺旋藻的单细胞或原生质球，并用7.0kGy左右的γ射线为筛选压力，得到了4株多糖含量分别比出发品系高32.8%，17.3%，23.4%和42.3%的形态突变体。赵爱娟采用60Co-γ射线分别对小球藻和等鞭金藻进行了诱变，研究表明小球藻的最适辐射剂量为100Gy、剂量率为8Gy/min，此辐射条件下小球藻的EPA含量比对照组提高了2.93%；等鞭金藻的最适辐射剂量为500Gy、剂量率为15Gy/min，辐射处理后EPA的含量比对照组提高了46.27%。由此可见，射线诱变育种的关键在于选择适宜的辐射参数。

2.化学诱变育种

与物理诱变相比，化学诱变剂产生的染色体畸变比例较小，更多的是产生点突变。常用化学诱变剂有烷化剂、碱基类似物、抗生素、羟胺和吖啶等，价格便宜，操作简单，引起突变的范围广。诱变剂对植物组织或细胞、基因的诱变有一定专一性，因此广泛适用于微藻的诱变育种，并且取得一定成效。赵爱娟采用EMS、60Co-γ射线两种方法对海水小球藻和等鞭金藻进行诱变，结果表明，群体生长水平虽受到一定抑制，却提高了藻细胞中EPA和DHA的含量。其中EMS诱变处理的效果较明显，小球藻EPA和DHA的含量分别提高了44.69%和72.61%，等鞭金藻中EPA和DHA的含量分别是对照组的1.8倍和14倍。Sivan等用MNNG处理紫球藻获得的突变株可抗除草剂diuron和光系统Ⅱ抑制型除草剂atrazine。Cohen等用除草剂SAN29785作为生长抑制剂，从钝顶螺旋藻和紫球藻中筛选到生长速度及多糖、粗脂含量均高于出发株，且富含γ-亚麻酸的突变株（王松，2015）。

3.生物诱变育种

目前常用的生物诱变育种手段主要有细胞融合技术和转基因技术。细胞融合技术能缩短育种周期及提高变异频率，拓宽育种领域；基因工程育种具有目标明确、针对性强等特点，但安全性还有待进一步验证。于莘明等将产DHA的绿色巴夫藻与生长迅速的四鞭藻成功融合，获得了快速高产DHA的新融合子。Tjahjono等使用哒草伏、氟啶酮、烟碱等3种除草剂对雨生红球藻进行诱变，得到抗抑制物的突变体，然后将任意2种或3种突变体进行原生质融合，得到的杂交株产类胡萝卜素的能力比亲本和野生型高3倍。通过转基因技术，微藻也能像细菌、酵母那样表达外源基因。目前不少哺乳动物的蛋白在微藻中得到了经济可行性的表达，如抗体、激素、疫苗。MayWeld等在衣藻中导入外源基因，成功表达了重要的抗体蛋白HSV8-lsc。Cordero等将小球藻中高效表达的茄红素基因导入到莱茵衣藻中，结果使得莱茵衣藻的类胡萝卜素和叶黄素的表达量增加1倍。基因工程育种简化了常规藻种的生产过程和有效降低生产成本，显示出广阔的应用前景。

（六）DHA和EPA的提取

随着对DHA和EPA的生理功能等方面的深入研究，其在药品和高级营养品方面的纯度要求也不断提高，很多发达国家都在研究分离制备DHA和EPA的技术，努力开发出高纯度的DHA和EPA单体，以满足市场需求（石雨等，2014；张汐等，1997）。

目前，分离提纯DHA和EPA的主要方法有（石雨等，2014）：利用不同脂肪酸或脂肪酸盐低温时在溶剂中的溶解度不同进行分离的低温结晶法；尿素分子在结晶过程中与饱和脂肪酸和单价不饱和脂肪酸能够形成晶体包合物析出，但是多价不饱和脂肪酸却不易被尿素包合，经过滤除去包合物，就能得到较为纯净的多价不饱和脂肪酸的尿素包合法；利用混合物组分挥发度的不同而进行分离的分子蒸馏法；通过调节压力和温度使各组分在超临界流体中的溶解度发生巨大变化而使之分离的超临界流体萃取法；利用微生物酶分离提取的酶法；利用吸附剂选择性吸附分离多价不饱和脂肪酸的吸附分离法。

1.超临界流体色谱法

结合C18柱和硅胶柱不同的分离机理和效果，杨亦文等以C18和硅胶柱为固定相、超临界二氧化碳为流动相的超临界流体色谱法分离DHA和EPA，纯度大于98%（张穗等，1999）。

2.超临界二氧化碳精馏与硝酸银络合结合法

赵亚平等将超临界二氧化碳精馏与硝酸银络合这两种方法结合起来，对DHA和EPA进行了高纯度的分离提取。首先对鱼油进行乙酯化获得鱼油乙酯，此时测得DHA 和EPA的相对含量分别是28.2%和8.0%。然后通过硝酸银水溶液进行预处理并采用超临界二氧化碳精馏进行分离，可获得纯度在90%以上的DHA和EPA混合物，以及纯度高达99%的DHA单体。

3.低温结晶、减压蒸馏及薄层色谱逐步提纯法

北京师范大学的陶海荣等先将鱼油进行皂化、酸化处理，经水洗得到鱼油混合脂肪酸，其中EPA含量为5.6%，DHA含量为6.8%。然后采取低温结晶法，用丙酮—干冰制冷液冷却至-47℃，恒温搅拌20min后去除溶剂，DHA和EPA的含量分别提高到了27.3%和10.1%。再将混合脂肪酸甲酯化，在氮气保护下进行减压蒸馏，分别收集187°～192°和204°～218°的馏出物，最后用薄层色谱法处理，经气相色谱分析，分别得到含量为99.1%的EPA和99.4%的DHA甲酯化产物，实现了DHA和EPA的高纯度分离提取。

4.酶法

较物理和化学方法而言，酶法分离提取EPA和DHA更具优势，反应条件温和，纯化效率高，节约能源，操作简单易行。吴可克等通过用假丝酵母脂肪酶催化鱼油制得含有含量大于50%的EPA和DHA的产品。针对藻类样品，可用溶剂与酶的混合液提取EPA和DHA，不但可有效地破坏细胞壁，而且效率较高。

5.超声波法

超声波在液体介质中传播产生特殊的“空化效应”，不断产生无数内部压力达到上千个大气压的微气穴，并“爆破”产生微观上的强大冲击波作用于样品上，使其中的EPA和DHA被“轰击”逸出。超声波的作用使介质内各点受到的作用一致，样品萃取更加均匀。超声波可降低提取温度、缩短提取时间、减少溶剂用量、较好地保持EPA和DHA品质，一定程度上可提高提取率，常与其他方法结合使用，有助于提高提取效率。近年来，也有研究者研究无溶剂超声波提取EPA和DHA的方法，环保高效，但大规模工业化应用有待进一步完善。

6.尿素包合法

本法按照脂肪酸混合物不饱和程度的差异进行分离，尿素分子在结晶过程中可与饱和脂肪酸或单不饱和脂肪酸形成稳定的晶体包合物析出，而多不饱和脂肪酸双键较多，碳链弯曲成一定的空间结构，不易被尿素包合，可采用过滤方法得到纯度较高的多不饱和脂肪酸。尿素包合法是目前较为常用的多不饱和脂肪酸分离方法，该法设备简单、操作简便、成本较低、操作温度较低，能较好地保留DHA和EPA的营养及生理活性。

但此法在应用中溶剂消耗量大，同时伴有溶剂回收和环境污染问题，包合后产品脱色脱臭过程困难，分离效果受到结晶温度和尿素用量的影响，为提高产率多采用多次尿素包合法来提取（吴昊等，2010；单幸福等，2016）。

7.分子蒸馏法

分子蒸馏法利用混合物组分挥发度不同而将其分离，是普遍使用的分离方法。此方法一般在相对于绝对大气压1.33～0.0133Pa的高真空度条件下进行，此时脂肪酸分子克服相互间引力，挥发度提高，因而蒸馏温度较常压蒸馏低，减少了高温对EPA和DHA的破坏。蒸馏时饱和脂肪酸与单不饱和脂肪酸先被蒸出，双键较多的不饱和脂肪酸最后被蒸出。

此法操作温度低，有效防止EPA和DHA受热氧化分解，分离效果好，产品品质优。但此法不能将分子量接近的EPA和DHA分开，需要的高真空设备成本高，耗能也较大，可将此法与尿素包合法等结合使用，可大幅度提高产率。

8.吸附分离法

吸附分离法是利用吸附剂选择性吸附分离多不饱和脂肪酸进行分离。部分金属离子能与不饱和脂肪酸的双键形成络合物，将部分金属离子固定在吸附剂上，因脂肪酸饱和度不同，其在吸附剂上的分配系数不同而得以分离。不饱和脂肪酸的双键越多，络合作用越强，形成的络合物也越稳定。

此法分离效果好，产品纯度高，但是有时产品易被某些洗脱剂污染，且分离量少，只适合于实验室研究，不适用于工业化量产。

9.脂肪酶浓缩法

此法可将含有多种脂肪酸的甘油三酯进行选择性水解，含有EPA和DHA的甘油三酯被脂肪酶水解的速度比不含二者的甘油三酯水解速度慢，由此富集多价不饱和脂肪酸甘油三酯，可将此法与其他分离方法结合使用完成EPA和DHA的提取分离。

10.层析法

目前，一般采用的脂肪酸分离层析法有柱层析、薄层层析、气相层析和高效液相层析法。此法利用EPA、DHA与饱和脂肪酸、低不饱和脂肪酸的极性不同，在两相间逆流分配系数的不同进行分离。使用的层析体具有耐久性，层析柱可反复利用，分离效果好，产品纯度高。但因洗脱液是有机溶剂，且不易除去，易对环境造成污染，目前还不适用于工业化生产，有待进一步完善。

三、花生四烯酸（AA）

花生四烯酸（arachidonic acid）是5，8，11，14二十碳四烯酸，简称AA。它含有20个碳原子，4个双键，第一个双键起始于甲基端的第6个碳原子，故属于ω-6系列的多不饱和脂肪酸，简记为20∶4（ω-6）（图3-3）。

图3-3　花生四烯酸结构式

作为人体必需脂肪酸，花生四烯酸是人体前列腺素合成的重要前体物质，在人体中分布最广、含量最高。在人的脑和神经组织中，AA含量一般占总PUFAs的40%～50%，在神经末梢甚至达到70%。在正常人的血浆中的含量也高达400mg/L。母乳中含有丰富的AA，特别是在授乳第一周后，母乳中AA的含量约占类脂物总量的0.4%，是母乳中含量最高的一种多不饱和脂肪酸（王啸等，2004；于长青等，2009；李丽娜，2009；肖爱华，2008；施东魁等，2007；姚昕等，2004；曹刚刚，2015）。

花生四烯酸的应用领域十分广阔，特别是在降血脂、抑制血小板聚集、抗炎症、抗癌、抗脂质氧化、促进脑组织发育等方面具有独特的生物活性。因人体内的花生四烯酸主要靠从外界摄取，所以加强对花生四烯酸的研究与开发具有非常重要的作用。

鉴于AA广泛的生物活性、对人类健康的积极作用，加之其来源非常有限，获取富含AA的生物资源成为研究的热点。目前获取富含AA的生物资源的途径主要包括基于生物技术手段改造培养微生物获得AA和培养特定藻类获得AA（于长青等，2007）。

（一）从微生物途径获得AA

与用动植物油生产AA的方法相比，通过改造培养微生物来生产AA有诸多优势：生产周期短，不受场地、气候、季节、资源的影响，可以利用多种菌种和培养基。基于此，产AA菌株的发现及其发酵工艺条件的改进成为主要研究内容（王啸等，2004）。

1.新菌种的发现及培养

从20世纪70～80年代开始，用发酵法生产花生四烯酸的研究在欧美、日本等国就率先展开。如1979年Lizuka等发现Penicillium cyaneu菌体内富含AA。1987年Yamada等获得的多株来源于土壤的AA产生菌，经选育获得一株高产菌Mortierella elongata IS-5，利用葡萄糖作碳源进行发酵生产AA。1989年，ShiMen等在5L罐分批培养IS-4生产AA。1991年，Baipai等采用Mortierella alpina ATCC16266生产AA。1996年，Eroshin等诱变出多头被孢霉VKM-F-953菌株。

2.改进工艺条件

1990年，Sajbidor等探究了发酵培养基C/N比对真菌生产AA的影响。1991年，Intriago等发现高渗透压可以促进Flexibacter菌产AA。腺苦酸环化酶在高渗透压作用下受到抑制，使胞内cAMP水平下降，cAMP对脱饱和酶有负调节作用，因此AA的含量得到升高。1996年，吴水清等研究表明，以6%（W/V）葡萄糖为碳源、0.3%（W/V）蛋白胨等为氮源，有利于多不饱和脂肪酸产生菌A 60细胞生长和产油脂。1998年，黄惠琴等研究表明，培养基中添加2%的低浓度玉米油、橄榄油、豆油有利于高被孢霉M10AA的合成。1999年，他们采用变温培养、葡萄糖分批加料、菌体老化等使高被孢霉M10花生四烯酸产率得到提高。当温度为25℃时，菌体干重和花生四烯酸产率最大，这与Gandhi及Singh的研究结果是一致的。2002年，贡国鸿等在温度为30℃、pH为9.0，以80g/L葡萄糖为碳源、酵母粉为氮源的条件下，对被孢霉菌49-N18AA产量进行了分析，结果显示此菌株性状稳定且高产AA。研究表明，发酵法工业化生产AA油脂是完全可行的。周蓬蓬等于2002年研究发现对被孢霉M3-18中己糖单磷酸途径的关键酶——葡萄糖六磷酸脱氢酶活性的变化与生物量、总油脂产量、花生四烯酸含量及产量成正相关。周蓬蓬、余龙江等报道0.3%毛霉菌油对被孢霉生长和油脂产量基本上没有影响，但可显著提高花生四烯酸含量。2003年他们通过摇瓶实验发现，以含糖150g/L的玉米粉糖化液为碳源，高山被孢霉M20突变株AA产量得到提高。

（二）从微藻途径获得AA

由于具有陆生植物所不具备的分子结构及生理、生化特性，微藻有着特殊的生物活性和保健功能。可以说微藻不但是某些药用成分的富集者，而且也是天然活性物质的反应者，从微藻中提取具有不同保健功能及疗效的活性物质已经成了关注的焦点（卞进发等，2003；王冬琴等，2013；赵大显，2004）。

国外早在20世纪50年代就开展了微藻脂肪酸含量及组成的分析研究。

微藻可以产生丰富的ω-3系列的PUFA，如紫球藻（Porphyridum cruentum）、拟微绿球藻（Nannochloropsis sp.）、三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum）和蒜头藻（Mondus subterraneus）可产生丰富的EPA，隐甲藻（Crypthecodinium cohnii）和盐生色胞藻（Chroomonas salina）含有DHA。但是，微藻中ω-6系列的PUFA含量相对较少，在任何有机体中都没发现高含量的20∶3ω-6，淡水藻中几乎不含AA，大多数的海水藻类AA占总脂肪酸的含量不高，只有少数几种藻类含有较高的AA。

迄今为止，只有两种微藻含有丰富的AA。一种是红藻门的紫球藻（Porphyridum cruentum），在逆境下，其AA占总脂肪酸的含量可达到40%。另一种是缺刻缘绿藻（Parietochloris incisa），是一种球形细胞的群体淡水绿藻，在氮缺乏的条件下，其AA占总脂肪酸的含量最高可达到60%。这两种藻极有希望用于AA的工业化规模生产。

利用微藻来生产不饱和脂肪酸，目前还处于实验研究和中试阶段。当前在藻种的筛选、培养条件优化和反应器设计等方面已开展了大量研究工作，最终还要借助于基因工程和原生质体融合等现代生物技术，对藻种进行基因改造、筛选，完善发酵工艺技术，同时建立简单高效的PUFAs浓缩技术。

四、α-亚麻酸（ALA）

ALA是ω-3不饱和脂肪酸，广泛存在于自然界，化学名为全顺式9，12，15-十八碳三烯酸。ALA是EPA和DHA的前体。ALA在体内通过一系列去饱和反应及碳链延长反应可以转化为高不饱和的DHA和碳链更长的EPA（图3-4）（杨静等，2011）。

图3-4　α-亚麻酸结构式

ALA是一种人类自身无法合成的必需脂肪酸，主要通过食物来获得。ALA主要来源于大豆、核桃、油菜籽等植物。与提取于深海鱼类的ω-3多不饱和脂肪酸相比较，α-亚麻酸具有价格低廉、更易于获得的优势（孙兰萍等，2011）。

ALA可通过抗炎、抗血小板的凝集和血栓形成，降低血压、降低血脂、抵抗心律失常等机制预防心血管疾病；ALA可抑制促炎细胞因子的产生和促凝细胞因子，如前列腺素E2、血栓素AX2和白三烯B4的生成，预防心血管疾病的发生发展。大量的临床数据通过葡萄糖代谢、血脂、炎症、血小板聚集、氧化应激、血压等多个角度，佐证了ALA可以降低心血管疾病的发病风险（吴俏槿等，2016）。

五、γ-亚麻酸（GLA）

γ-亚麻酸（gamma linolenic acid，GLA），学名：6，9，12-十八碳三烯酸，属于全顺式多不饱和脂肪酸，分子式为C18H30O2，分子量为278，是无色油状液体，不溶于水，易溶于石油醚、乙醚、正己烷等非极性溶剂。GLA在空气中不稳定，尤其高温下易发生氧化反应，在碱性条件下易发生双键位置构型的异构化反应，形成共轭多烯酸（刘胜男，2015； 贾曼雪等，2008；田歆珍等，2008；张峻等，1993；黎志勇等，2010）。

1919年，Heidusehka在分析月见草油时发现一种新的脂肪酸，为α-亚麻酸同分异构体，命名为γ-亚麻酸。1927年，Elbenr等利用臭氧降解反应测定出其结构（图3-5），1949年GLA结构进一步得到证实（周同永等，2011；魏莲，2002）。

图3-5　γ-亚麻酸化学结构

（一）GLA的生物来源

1.GLA的植物来源

植物中玻璃苣的GLA含量为21%～25%。此外，黑加仑、微孔草、月见草、华山松子等也富含GLA。但由于易受地域、季节、气候等因素影响，植物中的GLA产量和质量会受到一定影响；同时，复杂昂贵的精加工处理过程大大增加了植物GLA的生产成本，使其潜在的应用受到限制。另一个问题是从植物种子中提取的GLA带有异味，存在潜在的安全性问题。

基于上述，目前关注的焦点已从寻找GLA植物资源向通过基因工程的手段提高现有GLA植物中GLA的含量方向转移，且取得了一定的成果（苏桂红，2004）。

2.GLA的微生物来源

GLA的微生物来源主要是微藻和真菌，包括被孢霉属、根霉属、小克银汉霉属等以及兰丝藻和小球藻等。近年也有利用微生物发酵法生产GLA，目前的成本控制仍旧是最主要的问题。但通过微生物发酵法生产GLA，仍具有良好的应用前景（魏莲，2002）。(www.xing528.com)

（二）GLA的代谢

作为人体必需脂肪酸，GLA是人体组织生物膜的组成成分，是维持细胞正常功能和增加机体抗病能力的重要成分。油酸在Δ12-脂肪酸脱氢酶的催化下形成亚油酸（linoleic acid，LA），再经Δ6-脂肪酸脱氢酶的催化转化成GLA。GLA在其他酶的催化下经过一系列延长和脱氢，可进一步转化成AA、DHA等长链多不饱和脂肪酸。Δ6-脂肪酸脱氢酶是合成长链多不饱和脂肪酸的限速酶。当Δ6-脂肪酸脱氢酶受到抑制时，会妨碍体内亚油酸向GLA转化，导致前列腺素缺乏，引起多种疾病。

（三）GLA的营养价值和生理功能

自1919年发现γ-亚麻酸以来，许多学者对其结构、药理和毒理方面做了大量研究，而对G LA的生物学和医学研究开始于20世纪70年代，由于其能缓解治疗某些疾病，具有重要的生理功能，因此，人们对GLA关注日益增强（吴俏槿等，2016；贾曼雪等，2008；周同永等，2011；慕鸿雁等，2004；施跃峰，1998）。

1.抗菌

GLA对多种革兰阴性菌、阳性菌及藻类的生长抑制作用早已被证明。GLA进入细胞壁后，结合或插入细胞膜，改变膜的流动性及其他生理性质，从而使菌体生长受到抑制。Ohta等研究10种脂肪酸对金黄色葡萄球菌野生株及抗甲氧西林突变株（MRSA）的细胞毒性作用，发现多不饱和脂肪酸中GLA表现出最大抗菌活性。在革兰阴性菌中，Gianarellox-Bourbcalis E J等人证实GLA对铜绿假单胞菌（MIC=200～300μg/ml）和大肠杆菌等都有抑制作用。

2.抗HIV感染

GLA对HIV病毒有抑制作用。Kinehingtin D等将HIV感染的细胞在添加GLA-锂（Li-GLA）的培养基中培育4d后发现，大约有90%的HIV感染细胞被杀死，未被感染的对照组细胞只损失了20%，在抗氧化剂维生素E同时存在的情况下，Li-GLA的杀毒作用明显降低，所以认为GLA对HIV的选择性杀伤作用可能与膜脂质过氧化状态的变化有关。Mpanju等在相似的实验里还发现，在HIV复制时GLA的杀伤作用最大，因此GLA被认为是有前景的抗反转录病毒的潜在药物。

3.降血脂、抗血栓性心脑血管病

GLA具有明显地降低高血脂病人的血脂和血清胆固醇水平的功效，其活性是LA的160多倍。GLA可降低血浆甘油三酯、胆固醇、β-脂蛋白的浓度，临床统计显示，总有效率分别达到81.5%、68.2%、64.8%。

GLA在抗血栓性心脑血管病方面功效显著，它能明显地抑制体内血小板的凝集和血栓素A2合成。血栓素A2（TXA2）是内源性最强烈的血小板聚集剂和血管收缩剂，前列腺素则是最强烈的血管扩张剂。GLA作为前列腺素的前体，一方面通过其抑制血小板的聚集；另一方面还通过DGLA抑制血小板TXA2合成酶的活性，从而调整TXA2和前列腺素的比值来改善心脑血管，在临床上常用于防治冠心病、心肌梗死、阻塞性脉管炎等疾病。

4.预防和治疗高血压、动脉粥样硬化

GLA在体内可转化为血压调节物质PGE1和PGE2，有抑制血管紧张素合成的作用，可直接降低血管张力，对高血压患者的收缩压和舒张压有明显的降低作用。Fan等研究发现，喂食GLA可以增加小鼠巨噬细胞来源的PGE1。通过抑制血管平滑肌细胞的DNA合成，而抑制血管平滑肌细胞的无节制繁殖，从而起到抗动脉粥样硬化的作用，该效果可以被环氧合酶所抑制，外源添加PGE1可消除该抑制效果，说明GLA可能通过环氧合酶依赖方式来有效抑制血管平滑肌细胞的DNA合成。

5.抗肿瘤

GLA已被确认对多种肿瘤细胞乳腺癌、肺癌、皮肤癌、子宫癌、卵巢癌、前列腺癌及胰腺癌等有明显的抑制作用。研究表明，GLA对培养的人肝癌、骨肉瘤及食管癌细胞生长具有明显抑制作用。Jiang等发现，在体外GLA可以抑制HGF/SF引起的肝癌细胞转移性及侵袭性，用GLA处理24h后，在肺癌细胞、乳腺癌细胞、黑色素瘤细胞及肝癌细胞中，抑制细胞移动的胞间连接分子E-黏着蛋白表达量显著增加，但LA和AA均无此效果。GLA的抗肿瘤活性可能在于分子自身改变细胞的脂肪酸组成，增加了多不饱和脂肪酸的含量，从而改变了细胞膜脂酰基团的组成，膜上运输蛋白、离子通道、某些受体及酶的性质受到影响，从而产生抗肿瘤作用。

6.抗炎

研究发现GLA对类风湿性关节炎、肠炎、脉管炎、肾炎等多种炎症具有疗效或改善作用。实验表明，喂服3～6g/d的GLA可以导致血清GLA、DGLA和AA增加，嗜中性白细胞磷脂中DGLA亦明显增多，但其中GLA和AA水平无任何变化。同时还观察到服用3g/d GLA 3周后，嗜中性粒细胞合成更少的白三烯B4和血小板活化因子。这些数据提示，GLA的抗炎效果是通过在嗜中性粒细胞等炎症相关细胞中升高DGLA含量，并减弱AA生物合成而实现。

7.改善糖尿病并发症

由GLA组成的磷脂可增强细胞膜上磷脂流动性，增加细胞膜受体对胰岛素的敏感性，而由GLA生成的前列腺素可增强腺苷酸环化酶活性，提高胰岛β细胞胰岛素分泌，减轻糖尿病病情。糖尿病性神经病变会出现代谢和脉管的异常，研究发现，这两种主要代谢障碍是因损害Δ6-脱氢酶后，LA向GLA转变的正常脂肪酸代谢不能进行，从而降低了Na+K+-ATP酶活性。糖尿病人补充外源性GLA，可能有助于改善神经纤维敏感性。

8.其他作用

GLA可用于肥胖的治疗、美容及可以增强人体的免疫功能。GLA可有效防止阿司匹林引起的脱氢酶去饱和抑制作用，保护胃黏膜，而且促进AA和前列腺素前体物质的合成而抑制溃疡和胃出血；GLA还可以通过转化为前列腺素，促进类固醇的产生，维持更年期妇女激素平衡，缓解更年期综合征，对月经前期综合征、痤疮等也有治疗效果。

（四）γ-亚麻酸的提取工艺

1.γ-亚麻酸发酵工艺及操作要求

（1）斜面培养：让经过诱变处理的AS3.3410深黄被孢霉菌在斜面培养基上于28℃培养72h，同时使其活化。将活化后的菌种接种于种子培养基，用若干个250ml的摇瓶分别装液50ml，在30℃下、150r/min的旋转式摇床上培养30～36h，并以1/20的接种量接种。

（2）一级种子培养：28℃/24h，孢子接种量2×10个/ml，通气量0.5/min，搅拌速度200r/min。

（3）二级种子培养：28℃/20h，移种量10%，通气量0.8/min，搅拌速度180r/min。

（4）发酵产脂培养（三级发酵）：25℃/56～60h，移种量12%，通气量1/min，搅拌速度160r/min。

（5）追加补液发酵：发酵48h后追加补液，有利于提高产品含量。

发酵过程中产生的菌油中GLA含量占油脂总量的8%～12%。

2.γ-亚麻酸的提取工艺

收获菌体→造粒、烘干→萃取油脂→纯化→质量检测。

由于含γ-亚麻酸的油滴存在于菌体细胞内，所以细胞破壁是必需的，用乙醇和正己烷进行分步抽提，氯仿、甲醇等体积混合溶剂也可用来抽提。菌体得率25%～30%，油脂含量40%～45%，其中GLA含量5%～12%，可与月见草油相媲美，月见草油油脂中含GLA为3%～15%。

（五）γ-亚麻酸的分离纯化

γ-亚麻酸（GLA）的分离纯化方法有：根据脂肪酸分子量大小不同的分子真空蒸馏法；超临界流体萃取法；利用脂肪酸不饱和双键特性的尿素包埋法，银离子络合法；利用脂肪酸凝固点差异的低温结晶法；根据脂肪酸溶解度差异的脂肪酸金属盐法；根据脂肪酸极性差异的柱色谱法等（孙兰萍等，2011）。

（六）γ-亚麻酸产生菌的低能离子束诱变选育

为了得到γ-亚麻酸（GLA）高产菌株，刘胜男、王亚洲等开展了γ-亚麻酸产生菌的低能离子束诱变选育的实验，以深黄被孢霉As3.3410为出发菌株，利用氮离子（N+）注入诱变，并采用马来酰肼抗性筛选和红四氮唑（TTC）法相结合对突变株进行筛选。通过离子束诱变及抗性筛选的研究，找出了获得高产GLA深黄被孢霉的诱变筛选体系，该诱变筛选体系快速高效，可以对诱变后的突变株进行定向筛选，最终获得了一株高产突变株F312。试验结果表明，①采用10keV的氮离子（N+）进行诱变，最佳离子束诱变剂量为1.56×1015cm-2。②马来酰肼的最佳筛选质量浓度为40mg/L；TTC法酶活测定的条件为：温度35℃、pH8.4、TTC质量浓度8g/L、反应时间1h。③通过反复的诱变筛选，最终筛选出一株遗传性稳定的高产突变株F312，GLA产量达到1236mg/L，比出发菌株（480mg/L）提高了157.5%（刘胜男等，2015）。

六、二十二碳五烯酸（DPA）

DPA即二十二碳五烯酸（docosapentaenoic acid），属于ω-3型多不饱和脂肪酸（polyunsaturated fatty acid，PUFA），是人体难以合成、需由食物提供的必需脂肪酸。其与人体的生理功能密切相关（巫小丹等，2016）。

（一）DPA的来源

DPA和DHA统属于ω-3多烯脂肪酸，是一类动物和人体自身不能合成，需要完全从食物中摄取的一类必需脂肪酸。目前人类使用的ω-3多烯脂肪酸产品中的有效成分多来自深海鱼油和海豹油。但随着世界海洋渔业资源告急，以及鱼油易受重金属污染，鱼油产品质量受环境影响较大等问题的存在，鱼油的应用受到限制；每年北极地区对海豹的屠杀更是引起全世界的不满。近年来的研究表明，海洋微藻才是ω-3多烯脂肪酸的真正合成者，鱼类和海豹体内的ω-3多烯脂肪酸均是来源于各自的食物链。

另一方面，不同的ω-3多烯脂肪酸其生理功能也不同，海洋鱼油及海豹油在含有DPA和DHA的同时，也含有大量的二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）。由于摄入EPA会干扰人体对花生四烯酸的吸收，因此会对青少年的视力及大脑发育产生不利影响。

海岸带微藻易于培养和易于控制生产规模，生长迅速，总脂含量高（达细胞干重的40%），多烯脂肪酸可占总脂肪酸的20%～30%，且微藻油脂肪酸组成较简单，EPA含量很低。因此，利用海洋微藻生产DPA和DHA越来越受到人们的重视。

（二）DPA的化学性质

DPA即二十二碳五烯酸的英文名（docosapentaenoic acid）的缩写，分子式为C22H34O2[CH3CH2（CH2CH=CH）5（CH2）4COOH ]，分子量约为330.5，甲酯沸点为138～146℃。常温下为无色或淡黄色液体。

DPA属于多不饱和脂肪酸（含有两个或者两个以上的双键，且碳原子数为16～22的直链脂肪酸），因而能够发生脱水、聚合、缩合、卤化、脱羧、氢化、异构化及氧化等反应，获得多种衍生物（图3-6）。

图3-6　DPA的化学结构式

（三）DPA的生理功能

1.健脑作用

DPA是人乳中一种重要的多烯脂肪酸，它同样是人脑组织的、神经细胞的主要组成成分。人乳中的DPA成分对婴儿的神经系统以及大脑的发育具有重要的意义。其总量约占脑细胞中脂肪酸总重的10%。DPA在胎儿大脑形成及心血管系统的生成中具有重要价值。所以，孕妇在受孕和哺乳期间必须摄入一定量的DPA，新生儿从出生至一岁半期间为脑部发育最快的时期，必须注重DPA的补充。DPA具有延缓神经系统衰老的作用，对老年性痴呆症有一定防治作用。

2.保护视力

在人体各组织细胞中，DHA含量最高的是视网膜细胞，DHA能保护视网膜、改善视力。DPA也能对DHA的这一生理功能产生协同作用。

3.降低血脂，预防动脉硬化

DPA和DHA显著的降血脂效应主要表现为升高血清密度，降低血清甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白、极低密度脂蛋白的作用。其作用机制：增加胆固醇从肝脏的排泄，减少内源性胆固醇合成，改变脂蛋白中脂肪酸的组成，增强其流动性，减少甘油三酯的合成。

4.提高免疫力与抗炎作用

DPA可以促进和提高人体的免疫力，对糖尿病、类风湿性关节炎、牛皮癣、大小肠炎等有治疗作用。

（四）利用微藻生产DPA的优点与前景

利用微藻生产DHA和EPA具有以下优点：

（1）微藻脂肪酸组成简单，使得分离纯化DPA的工艺过程相对于传统鱼油和海狗油更为简单。微藻油中含有相当含量的脂肪酸，在商业上降低了生产和分离的成本，同时也消除了通常鱼油所具有的异味。

（2）微藻具有较广泛的生长适应范围，具有工业化生产潜力。不受季节和气候限制，可全年生产。藻类培养还具有高密度培养的特点。

（3）由于环境和营养方式易被控制，从而能控制脂质产量和脂肪酸组成。

（4）利用基因工程技术进行油料菌种的改良是提高多烯脂肪酸产量的研究热点，可望育成高产多烯脂肪酸的工程藻种。

七、二十碳三烯酸

（一）二十碳三烯酸的来源

二十碳三烯酸是ω-9脂肪酸，首先由杰姆斯·米德发现。与其他一些ω-9不饱和脂肪酸相比，动物可以使二十碳三烯酸更新。它在血液中含量的增加是一种必需脂肪酸缺乏症的迹象。可以在软骨中发现大量的二十碳三烯酸（图3-7）。

图3-7　二十碳三烯酸的化学结构

（二）二十碳三烯酸的化学性质

蜂蜜酒酸，也被称为二十碳三烯酸，在化学上是一种羧酸与二十碳链形成的三亚甲基羧酸。第一个双键位于欧米茄结束的第九碳上。在生理学上，它的名称是20∶3（ω-9）。在脂氧合酶的存在下，细胞内的环氧合酶二十碳三烯酸可以形成各种羟基二十碳四烯酸（HETE）和hydoperoxy（氢过氧花生四烯酸）的产物（刘柳，2009；白娟等，2016；何静等，2016）。

（三）二十碳三烯酸的生理活性

二十碳三烯酸已被发现能够降低成骨细胞的活性，这可能是在治疗中抑制骨形成的需要注意的很重要的一点。环氧合酶通过不饱和脂肪酸的氧化在治疗炎症过程中发挥了很大的作用。比较典型的前列腺素H2与花生四烯酸是在结构上非常相似的二十碳三烯酸形成的。当花生四烯酸的生理水平低的时候，其他不饱和脂肪酸包括二十碳三烯酸和亚油酸被氧化，二十碳三烯酸转换为白三烯C3和D3（王晓晶，2014；卢美欢，2007）。

八、共轭亚油酸（CLA）

（一）共轭亚油酸的来源

亚油酸在碳9，12位置上有2个顺式的双键，是饮食中一种必需脂肪酸，主要存在于如大豆油、亚麻油、核桃油、苏子油、大麻油、棉籽油、葵花籽油、玉米胚芽油和瓜子油等植物油中。油脂中存在共轭二烯的结构并不是很常见的（陈忠周等，2000；张英锋等，2005）。

CLA主要存在于反刍动物牛和羊等的肉和奶中。这是由于在反刍动物肠道中厌氧的溶纤维丁酸弧菌亚油酸异构酶能使亚油酸转化成CLA，主要是以c-9，t-11异构体形式存在。故天然的CLA主要以反刍动物消化道的微生物代谢产物存在。CLA也少量存在于其他动物的组织、血液和体液中。植物食品也含有CLA，但其异构体的分布状况与动物食品显著不同。特别是具有生物活性的c-9，t-11异构体在植物食品中的含量很少。如在一般植物油中每克仅含有0.1～0.7mg CLA，且其中c-9，t-11异构体的含量少于50%。海洋食品中的CLA含量也很少（李珍等，2007）。

（二）共轭亚油酸的化学结构

CLA是由一系列含有碳9，10，11开始的共轭双键、具有位置和几何异构的十八碳三烯酸构成的。在这3种位置异构体中，均可能存在着以下几种构象：顺顺（cc），反反（tt），反顺（tc）。但从能量上考虑，有利于形成反式构象，因此迁移后的双键主要是反式构象。c-9，t-11和t-10，c-12异构体是含量最多的2种异构体。由于生物体内亚油酸异构酶专一地转化亚油酸成c-9，t-11异构体，故具有生物活性的异构体可能是c-9，t-11CLA（图3-8）（李珍等，2007）。

图3-8　共轭亚油酸的化学结构式

（三）共轭亚油酸的营养价值和生理功能

1.抗癌作用

经小鼠实验发现，CLA能减少致癌物引起的胸腺癌、皮肤癌、胃癌和结肠癌，生理浓度的CLA可杀死或抑制人类胸癌、结肠直肠癌和恶性黑色素瘤细胞。CLA不但可以调节细胞色素P 450的活性，也可以抑制致癌过程中涉及的如鸟氨酸脱羧酶、蛋白激酶C等酶的活性，抑制癌细胞中蛋白质和核酸的合成。CLA不同于亚油酸，可以降低动物癌症发病率，可作为动物的抗致癌食品来食用。食品中CLA的含量一般要求在0.05%～1%之间，作为正常人的食物，其中CLA的含量足以防止癌症和发挥其他生理活性（王瑾等，2009）。

2.降低血液和肝脏胆固醇

摄入胆固醇的兔和大颊鼠与对照组相比，摄入CLA的动物血液中总胆固醇水平及坏胆固醇水平均较低，产生动脉硬化症概率也更低。在CLA作用下，低密度脂蛋白胆固醇（LDL胆固醇）与高密度脂蛋白胆固醇的比例也可以得到降低。CLA的c-9，t-11和t-10，c-12异构体能抑制由花生四烯酸或胶原质引起的血小板聚集，从而达到抗血栓的目的。CLA可以减低白色脂肪组织和肝中三酰基甘油酯和脂肪酸的水平，防止肥胖，这可能是由于其抑制前脂肪细胞的增殖和分化而实现的。作为过氧物酶体增殖活化受体（PPAR）的配位体和催化剂，CLA可促进脂类代谢。在CLA异构体中，活性按如下顺序递减：c-9，t-11＞t-10，c-12＞t-9，c-11。因此，c-9，t-11CLA可能是其中最有效的异构体。在HepG2细胞中，t-10，c-12共轭亚油酸能够抑制三酰基甘油酯和胆固醇酯的合成以及载脂蛋白B的分泌，c-9，t-11共轭亚油酸不能抑制。在培养的3T3-L1脂肪细胞中，t-10，c-12共轭亚油酸能抑制脂蛋白脂肪酶活性，降低细胞内三酰基甘油酯和甘油酯的浓度，促进甘油酯释放到介质中（张三润等，2014）。

3.抑制脂肪沉积

在免疫系统刺激之后一般产生的组织分解（异化作用）会从诸如生长等重要生理过程中分走能量。CLA对免疫系统和发炎反应的效果类似于鱼油，可能以相似的机理发挥作用。在注入内毒素的老鼠中，CLA比鱼油更好地防止厌食和抑制生长等副作用。在对鸡的研究中发现类似的效果。免疫系统在像细菌内毒素等外界因素的恒定攻击下，CLA能参与能量分配并可促进生长。事实上，当用添加CLA食物饲养怀孕期和哺乳期母鼠时，生出的小老鼠比对照的小老鼠长得更快。断奶后持续地补充CLA使得这些小鼠的生长优势得到维持：吸收食物更有效，生长更快，且每单位所吃的食物长出的瘦肉更多。由于在奶中发现有CLA，因此它可能是重要的生长因子，在其他哺乳动物中同样也有相似的效果。CLA提高免疫系统的作用与其促进脾的白介素-2细胞和T细胞繁殖有关。这些实验结果表明，CLA在动物饲养中具有广阔的用途（张英锋等，2005）。

（四）共轭亚油酸的生产

为了能够在工业上生产CLA，微生物应该是便宜、容易培育和使用的，并且是可食用的。乳酸菌可发酵产生CLA，2种丙酸菌可以转换亚油酸成细胞外的CLA。嗜酸乳酸菌能比较有效地将亚油酸或甘油亚油酸酯转变为共轭亚油酸。其合成机制为：乳酸菌中含有亚油酸异构酶，其作用在脂肪酸的C12双键，能把亚油酸转化为c-9，t-11CLA，而不是t-10，c-12或t-9，c-11异构体。双键在C6上的脂肪酸会抑制其活性，双键在C9位置上的脂肪酸可提高其活性。得到的共轭亚油酸可直接从细胞培养液中提取。亚油酸异构酶是膜结合蛋白，能以细胞形式和分离出的膜形式反应。反应条件最好在4～12℃，pH在8.0～8.8之间，3h反应就已结束，可产生7.8mg/g共轭亚油酸。得到的CLA中c-9，t-11异构体的含量在98%以上（董明，2007；刘美等，2008；刘晓华等，2003；汤玉清等，2015）。

九、棕榈酸

棕榈酸，又称软脂酸（palmitic acid），学名十六烷酸，分子式C16H32O2，结构式CH3（CH2）14COOH（图3-9）。为白色带有珠光的鳞片，在许多油和脂肪中以甘油酯的形式存在。不溶于水，微溶于冷乙醇及石油醚，溶于热乙醇、乙醚和氯仿等。

图3-9　棕榈酸的化学结构式

（一）棕榈酸的来源

（1）棕榈酸的还原会产生鲸蜡醇，它以甘油酯的形式广泛存在于各种油脂中，如鱼油、乳脂、动物脂肪等。

（2）自然界中广泛存在，几乎所有的油脂中都有含量不等的软脂酸组分。我国特产的乌桕油中，软脂酸的含量可高达60%以上，棕榈树果实的棕榈油中含量大约为40%，菜油中的含量则不足2%。市售品棕榈酸一般熔点为57.5～62.5℃。

（3）用板油或棕榈油经水解、酸化，分离不饱和脂肪酸后得棕榈酸，然后经重结晶可得纯棕榈酸。

（4）将米糠油、椰子油、棕榈仁油等的混合脂肪酸经真空分馏而制得。

（5）烟草：OR，44；FC，9，15，18，41，43，50；OR，18，26；BU，9，18，26。

（二）棕榈酸的分离提取

棕榈酸是第一种从脂肪生成中产生的脂肪酸，亦可以由它产生更长的脂肪酸。软脂酸盐对乙酰辅酶A羧化酶有负面反应，乙酰辅酶A羧化酶是在发展的酰链中负责将乙酰携带者蛋白转为丙二酰携带者蛋白，因而可以阻止软脂酸盐的生成。乌桕油或棕榈油等水解、分馏、压榨分离不饱和脂肪酸后，经重结晶即制得棕榈酸。

（三）棕榈酸的营养价值及功能

（1）棕榈酸在甘油三酯中的位置分布对婴儿营养吸收的影响，许多研究证明棕榈酸结合在甘油三酯的Sn-2位时能够促进婴儿对脂肪的吸收。研究认为饮食中高含量的Sn-2棕榈酸能够增加矿物质的吸收，促进婴儿骨骼矿物质的沉积，所以Sn-2位棕榈酸对婴儿的骨骼发育是有益的（彭恭等，2012）。

（2）棕榈酸可为机体的生长发育、大脑活动、新陈代谢提供能量，是婴儿生长最重要的脂肪酸。结合在甘油三酯的Sn-2位的棕榈酸最容易被婴幼儿消化，可以促进机体对能量物质的吸收。当能量摄入不足时，婴幼儿会出现干瘦型营养不良，进而影响细胞结构和功能，对机体的新陈代谢影响严重。Sn-2棕榈酸可以促进钙、镁等骨骼矿物质的吸收，促进婴幼儿身体骨骼的生长，避免钙缺乏引起的佝偻病。心脏的正常搏动、神经冲动的传导、维持神经肌肉的兴奋都需要钙的参与。因此，棕榈酸是机体代谢过程中必不可少的饱和脂肪酸（王筱菁等，2007）。

十、二高-γ-亚麻酸（DGLA）

二高-γ-亚麻酸是前列腺素系列（PGE1）的前体，是最早发现的类二十烷酸系列物质之一。在正常人体血浆中，二高-γ-亚麻酸约占脂质总量的20%；在组织磷脂中，占所含脂肪酸的1%～6%。其生理功能与亚油酸、γ-亚麻酸的一些功能联系在一起。

（一）DGLA的来源

1.月见草含合成前体物质

月见草籽含油率达20%，其中亚油酸占70%左右，γ-亚麻酸占6%～9%，是已知的唯一含γ-亚麻酸的植物。γ-亚麻酸是人体的重要必需脂肪酸之一，它的重要作用在于，可在体内增长碳链而成为二高-γ-亚麻酸（DGLA），因为它是一类PG、PGE1的前体，所以有人称其为内源性心血管保护剂（沈阳药学院有机研究室，1986）。

2.微生物直接提取

国外有资料报道，从微生物被孢霉属高山IS-4体内提取DGLA，生产出二高-γ-亚麻酸，占菌丝体脂质提取物中总脂肪酸含量的23.1%。

（二）DGLA的化学结构

DGLA属ω-6系列多不饱和脂肪酸，它的碳原子数与类二十烷酸相同（图3-10）。

化学名：8，11，14-全顺式-二十碳三烯酸

结构简式：CH3（CH2）4（CH=CH-CH2）3（CH2）5-COOH

分子式：C20H34O2

图3-10　二高—γ—亚麻酸的化学结构

（三）DGLA的获得

国内主要采用的合成路线是以月见草油为原料，提取纯化γ-亚麻酸后，经还原反应、磺化反应、增碳反应、水解反应、结晶和脱羧6步反应制得DGLA（图3-11）。

图3-11　DGLA的合成路线

（四）DGLA的营养价值和功能

1.二高-γ-亚麻酸是心肌梗死的内源性保护剂——具有扩张血管的功能

研究表明，冠心病发病率与脂肪组织中二高-γ-亚麻酸（20∶3ω-6）水平减少这二者间的密切联系。哺乳动物20∶3ω-6的前体很可能是来自植物中的亚油酸（18∶2ω-6）。虽然人与大鼠或小鼠相比明显缺乏酶促过程，但花生四烯酸（20∶4ω-6）可由20∶3ω-6通过Δ5脱饱和形成。

给志愿者口服小剂量（0.1～1.0g）二高-γ-亚麻酸纯品，可以减少血小板聚集反应和血浆肝素中和活性。然而，被誉为没有冠心病的爱斯基摩人的血浆甘油三酯中20∶3ω-6有明显的增加，这是对众所周知的花生四烯酸由二十碳五烯酸（20∶5ω-3）所取代之外的补充。

Oliver组指出，在冠心病急性发作时所见到的游离脂肪酸大量释放可能有危险的后果。在许多血管活性物质中，与冠心病有关的是20∶4ω-6代谢产物，包括血栓素A2和白三烯。反之20∶3ω-6不会相当量地转变成有血管活性的血栓素或白三烯，并且不干扰体内前列腺环素的产生。但是由20∶3ω-6产生的15-脂质氧化酶产物是生物合成白三烯的强抑制剂。确实20∶3ω-6是PGE1生物合成的前体。PGE1是冠状血管扩张剂和游离脂肪酸释放的抑制剂。它还能引起纤维蛋白溶解，是一种已知的血小板聚集抑制剂。大量证据表明，20∶3ω-6的生物化学性质很适合于作为冠心病的天然保护剂（陈光荣，1985）。

2.二高-γ-亚麻酸有抗动脉粥样硬化的效应

二高-γ-亚麻酸（dihomo-γ-linolenic acid，DGLA）是一种二十碳多不饱和脂肪酸，结构为20∶3Δ8，11，14。它是生物合成前列腺素E1的前体物质，自身也具有抑制血栓素A2的活性作用，能有效抑制人体血小板聚集反应和分裂素的分泌，发挥抗动脉粥样硬化的效应。

3.二高-γ-亚麻酸用于合成前列腺素E1

我国前列腺素E1主要是采用生物合成法，即以高纯度的二高-γ-亚麻酸和羊精囊中提取的酶等为原料合成前列腺素E1（傅方浩等，1987）。

（五）DGLA的应用现状

二高-γ-亚麻酸在自然界中存在不多。由高山被孢霉生产的单细胞油脂商品如ARASCO、SUNTGA分别含40%和50%的花生四烯酸，而且还含2%～4%的二高-γ-亚麻酸和γ-亚麻酸，英国、荷兰已允许此类产品用在婴儿食品中，并推广到欧洲其他国家及中东、南亚和澳大利亚市场。