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检测击打性脑创伤的生物医学应用

时间:2023-11-20 理论教育 版权反馈
【摘要】:完成击打性颅脑创伤动物模型建立后,制备不同创伤程度的大鼠脑组织测试样本。mNSS评分和TTC染色结果表明实验成功制备不同创伤程度的击打性颅脑创伤模型。另一方面,由于鼠脑表层组织脂肪含量较低,因此鼠脑组织中神经纤维的太赫兹吸收波谱的测量采取对新鲜大脑表层组织测量太赫兹吸收波谱。图7-21不同程度脑创伤组织的太赫兹吸收波谱图7-22不同程度脑创伤组织的太赫兹吸收波谱测量结果及其模型拟合结

检测击打性脑创伤的生物医学应用

图7-19 石蜡包埋健康(完整)组织,1例脑膜瘤和2例脑胶质瘤(其中一个进行荧光处理)离体脑组织的(a)折射率和(b)吸收系数

颅脑创伤是当前常见的高致死、致残率疾病之一。神经科学领域将颅脑创伤根据创伤程度不同分为轻度创伤、中度创伤和重度创伤[73]。据估计,全球每年约有1 000万人由于脑创伤直接导致住院或者死亡,5 700万人遭受过脑创伤,其中,75%~85%为轻度创伤[74]。因此,不同程度颅脑创伤诊断和检测对其早期治疗和预后具有非常重要的意义,尤其对轻度颅脑创伤的成像检测和精确识别是当前神经外科领域的技术瓶颈。其主要病理表现有脑水肿、神经发炎、低血压、低血氧等。当前脑创伤的成像检测主要有计算机体层摄影(CT)[75]、弥散核磁共振成像[76]、PET[77]、光声成像[78]、荧光分子成像[79]等,其基本原理是基于脑创伤导致的水分变化或者血管变化实现检测。但是,当前的这些手段大都存在灵敏度低、设备庞大等缺点,并且无法实现轻度脑创伤的准确检测,容易耽误患者的治疗。因此,不同程度颅脑创伤的成像检测,尤其是轻度创伤的检测仍然是神经外科领域的热点和难点。太赫兹波对水分的高灵敏及太赫兹波成像技术的飞速发展给脑创伤成像检测技术发展带来了新的可能性。

1.动物模型制备

实验中,采用成年雄性Sprague Dawley大鼠建立了动物击打性颅脑创伤模型。动物实验模型采用经典的Feeney自由落体击打伤方法[80]

首先用50 mg/kg的戊巴比妥钠对大鼠进行腹腔注射麻醉。然后,将大鼠固定于立体定位架,颅顶朝上,固定完后进行颅脑顶部备皮。接下来进行右顶叶颅骨切开术。将头皮从中缝剥开,用牙钻进行开颅手术将硬脑膜暴露出来,开颅区域直径约为4.5 mm,操作时应避免硬脑膜撕裂。用一个直径4.5 mm、高5 mm、质量30 g的砝码分别从高度15 cm、25 cm、35 cm处自由落体击打裸露的硬脑膜从而制备轻度、中度和重度颅脑创伤模型。作为对照,实验中还设置了假性组,对没有创伤的正常大鼠也进行了相同的右顶叶颅骨切开术。模型制备成功后分别进行取脑。完成击打性颅脑创伤动物模型建立后,制备不同创伤程度的大鼠脑组织测试样本。所有样本按创伤程度分成四组,分别为假性组(sham)、轻度(mild)创伤、中度(moderate)创伤和重度(severe)创伤。

不同创伤程度模型制备成功后进行取脑,如图7-20(a)第一行所示。肉眼观察可见动物模型中创伤越严重会导致创伤灶区域越大。取脑后首先对创伤脑组织进行2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC)染色切片检测,切片厚度为2 mm,切片位置取创伤灶中部。典型的假性样本和创伤样本(轻度、中度、重度)对应的TTC染色结果如图7-20(a)第二行所示。结果显示,假性组即正常的脑组织的TTC染色切片除了脑组织本身的白质区域外没有呈现苍白色区域,而创伤组的脑组织在创伤灶周围出现苍白色区域,并且创伤越严重苍白色区域越大,这与理论上颅脑创伤的病理表现一致。

然后,为了在病理学上进一步确定颅脑创伤的损伤程度,在创伤24 h后对不同创伤模型进行神经功能损伤评估,评估采用优化的神经功能缺损评分(mNSS)。不同脑创伤程度模型的评分结果如图7-20(b)所示,评分取每组6个实验鼠的平均评分,并对其差异性进行了统计学显著性检验。统计学中一般采用P值进行显著性检验,对于事件显著性水平为P<x,表示该事件成立的概率大于(1-x)。结果显示,mNSS评分的结果为重度创伤>中度创伤>轻度创伤>假性组。以重度创伤为标准,假性组、轻度创伤组和中度创伤组的mNSS评分差异性的显著性检验P值均小于0.05,说明不同创伤程度的mNSS评分具有明显统计学差异,其评分结果与理论一致,并且与TTC染色检测结果呈现的创伤严重程度也一致。mNSS评分和TTC染色结果表明实验成功制备不同创伤程度的击打性颅脑创伤模型。

图7-20 不同程度颅脑创伤模型及神经功能缺损评分

2.击打性脑创伤的太赫兹波谱检测

水的差异性是目前核磁共振成像等成像技术实现脑创伤成像检测的重要依据之一,而太赫兹波对水含量差异十分敏感,因此结合不同程度脑创伤组织的太赫兹吸收波谱分析了太赫兹波与脑创伤组织相互作用机理及其吸收特征是十分有必要的。首先,采用太赫兹时域光谱仪(TDS,Advantest Corp.,TAS7500SP)对新鲜脑创伤组织的太赫兹吸收波谱进行了测量。测量方法采用透射模式,其动态范围大于70 dB,频率分辨率达到7.6 GHz。测试时,首先测试两片空的石英玻片(厚度均为500μm)的太赫兹吸收波谱,并将数据设为参考背景。然后,将不同程度的创伤模型取脑后用冰冻切片机取创伤灶中部40μm厚的切片,并夹于上述两片石英玻片之间。每类创伤组分别包含6个新鲜鼠脑样本,每个样本的测量位置取创伤灶击打位置周围3个不同的点,然后对3个点的吸收波谱取平均后作为每个样本的太赫兹吸收波谱。实验结果如图7-21所示,不同程度脑创伤组织在太赫兹波段的吸收系数具有如下关系:重度创伤>中度创伤>轻度创伤>假性组,这与脑创伤的严重程度是一致的,尤其是重度脑创伤组织对太赫兹波的吸收明显高于其他几种创伤程度,而假性组对太赫兹波的吸收最低。

由于大脑除了水分外的固体物质主要为脂肪等有机物质,还有少量无机盐,并且脂肪占了很大比重[81],因此,鼠脑组织中脂肪等有机物质的太赫兹吸收波谱的测量采用的方法为对组织脱水后测其固体物质的太赫兹吸收波谱。另一方面,由于鼠脑表层组织脂肪含量较低,因此鼠脑组织中神经纤维的太赫兹吸收波谱的测量采取对新鲜大脑表层组织测量太赫兹吸收波谱。每组各取6个样本,分别对两类物质的太赫兹吸收波谱取平均,然后根据神经纤维和脂肪等有机物质吸收波谱分别拟合不同程度脑创伤组织的非线性规划模型。拟合的吸收波谱和实测的吸收波谱如图7-22所示,结果显示,使用建立的非线性规划模型获得了很好的拟合效果。(www.xing528.com)

图7-21 不同程度脑创伤组织的太赫兹吸收波谱

图7-22 不同程度脑创伤组织的太赫兹吸收波谱测量结果及其模型拟合结果

3.击打性脑创伤的太赫兹成像检测

不同程度的脑创伤组织对太赫兹波的吸收具有明显差异,因此可以利用太赫兹波成像技术实现脑创伤的成像检测。成像系统频率采用2.52 THz,成像扫描步长采用250μm,输出功率设为70 mW。生物组织切片样本的温度仍然控制为室温23℃,成像环境中充入干燥空气,每次测试在湿度低于2%RH条件下进行测量。

首先,为了实现高对比度的创伤灶太赫兹波成像,需要确定合适的切片厚度。实验中对同一个大鼠颅脑创伤样本创伤灶中部连续的不同厚度的切片组织进行成像。采用的切片厚度分别为30μm、35μm、40μm、45μm和50μm,样本制备采用中度创伤模型,实验结果如图7-23所示。实验结果表明,30μm和35μm厚切片样本的太赫兹波成像结果中无法明显辨别创伤灶,原因是切片厚度太薄导致创伤周围水肿组织对太赫兹波的吸收太低,与正常脑组织相比,对太赫兹波的吸收差异性不明显。当切片厚度为40μm时,结果如图7-23中所示白色虚线框为创伤灶位置,周围红色区域为创伤灶周围因水肿引起的低透射率区域,此时非创伤侧的正常组织和创伤灶周围病变组织对比度较大,也符合其病理水肿特征。当切片厚度大于45μm时,成像结果中整个脑组织对太赫兹波的吸收都比较高,探测到的透射率极低,无法实现创伤及水肿区域的分辨。因此,结果表明40μm为比较合适的样本切片厚度。

图7-23 不同厚度切片样本的太赫兹波成像结果

确定太赫兹波成像过程中合适的组织切片厚度后,进一步对不同程度的大鼠脑创伤组织切片样本进行太赫兹波透射式成像实验并与核磁共振成像结果比较。核磁共振成像系统如图7-24所示,采用成熟的动物立体定位系统。不同程度脑创伤组织对应的核磁共振成像结果、实物照片和太赫兹波成像结果分别如图7 24(a)(b)(c)所示,从上至下依次为假性、轻度、中度和重度创伤样本。核磁共振成像采用7.0T小动物磁共振扫描仪进行检查,大鼠以1.5%~2%异氟烷吸入麻醉后,固定于线圈门齿槽,接1.5%异氟烷管道持续吸入麻醉状态并行磁共振扫描。选择T2加权序列(TR/TE 4 000/60 msec)进行扫描,扫描层厚为0.5 mm。磁共振图像处理采用公共软件ImageJ进行分析。对比不同创伤程度组织的太赫兹波成像结果发现,假性组样本的太赫兹波成像中,除了白质部分,其他不同部位组织的太赫兹波透射率比较均匀。而创伤组脑组织的太赫兹波成像结果与假性组具有明显差异,存在明显的低透射率区域,并且低透射率区域平均透射率大小关系为轻度>中度>重度,这与核磁共振成像结果呈现的趋势相同。

图7-24 不同程度脑创伤组织的(a)核磁共振成像结果、(b)实物照片及(c)太赫兹波成像

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