五氯酚对实验红鲫胚胎和卵黄囊仔鱼的毒性研究

五氯酚（PCP）因价格不高，在人类生产生活中应用广泛，在农业生产上主要用于杀虫和除草。由于五氯酚毒性大，在环境中很难自然降解，被美国环境保护署列为优先检测污染物，也是我国监测的一种潜在致癌污染物之一。

在我国南方的湖南、湖北、江西、安徽等大部分省、市的血吸虫病疫区曾有长时间使用五氯酚钠消灭血吸虫中间宿主——钉螺的历史。目前，我国已不再将PCP应用于消灭钉螺，但由于它经济实惠且高效，在防腐以及渔业等领域仍然没有更好的替代品，所以历史累积的PCP对环境的污染仍在持续。由于PCP是一类可产生复合毒性的有机污染物，所以即使很小浓度的PCP暴露仍然会对人体健康产生一定的风险，且发生五氯酚中毒后，没有有效药物作解毒治疗，所以必须对五氯酚的环境安全进行评估。鱼类毒性试验是最有效的方法，且是国家标准规定的评估方法之一。国外已经有实验斑马鱼、虹鳟等10余种实验鱼类，但在国内做环境风险评估必须使用本土鱼类完成生态毒理学研究。湖南省地方标准《实验红鲫遗传质量》已于2017年1月发布，实验红鲫二龄鱼的体长可达到100～200mm，平均体重约309.5g，利于试验的开展，所以我们就地取材，用南华大学实验室培育的红鲫进行试验探究。

本试验是在人为控制的化学品环境下，将实验红鲫胚胎暴露到PCP环境中进行毒性试验。这能更深入地了解实验红鲫应用于化学品环境评价的方法，为水资源污染检测等研究提供科学依据。对于红鲫的进一步推广应用来说，具有较大的意义。

1.实验目的

检测五氯酚（PCP）的生物毒性效应，以及实验红鲫作为指示动物应用于五氯酚毒性检测的可行性。

2.试验方法

以实验红鲫作为受试鱼类，采取静态试验方法。观察实验红鲫胚胎的孵化率、成活率、畸形率以及卵黄囊仔鱼的死亡率、畸形率和生长发育状况等指标，分析不同浓度的五氯酚对实验红鲫胚胎和卵黄囊仔鱼的毒性作用。试验步骤如下：

（1）预试验确定五氯酚浓度范围

1）胚胎阶段预试验：分为对照组及五氯酚浓度组。根据所查资料将五氯酚浓度设置为1μg/L、10μg/L、100μg/L、200μg/L、300μg/L、400μg/L六个浓度梯度。按照上述浓度范围分组，每组不投或投入相应的五氯酚，乙醇为助溶剂。之后分别将带有100枚受精卵的鱼巢放入烧杯内开始预试验观察。预试验持续4d时间，每天在10：00、15：00、20：00观察三次，拿出死亡的红鲫胚胎，并记录畸形胚胎数量。试验结束后，求出96h半致死浓度（96h LC50）。根据96h LC50设立一个五氯酚浓度梯度用于正式试验。所设置的最高浓度不得高于96h LC50。若第一次没有确定范围，就需要再设置浓度进行一次。

2）卵黄囊仔鱼阶段预试验：预试验设置一个空白组，六个五氯酚浓度组。根据所查资料将预试验的五氯酚浓度设置为1μg/L、10μg/L、100μg/L、200μg/L、300μg/L、400μg/L六个浓度梯度组。每组投入40尾卵黄囊仔鱼进行预试验。观察4天，记录卵黄囊仔鱼的异常行为以及鱼的死亡数量。求得96h半致死浓度（96h LC50），根据96h LC50设立一个浓度梯度用于正式试验，所设置的最高浓度不得高于96h LC50。

（2）暴露试验

1）实验红鲫胚胎阶段：根据预试验结果设置浓度梯度：10μg/L、40μg/L、70μg/L、130μg/L、250μg/L。在人工授精30min之后，开始试验。准备18个500mL的烧杯，消毒清洗干净。试验设有1个对照组，5个五氯酚浓度组，每组设3个平行试验组。准备好18块纱网做成的鱼巢，每个鱼巢上均匀地撒上100枚受精卵。再将每个鱼巢轻放到各个组的烧杯里，浸没在溶液之下。保证水温在18～22℃。

2）实验红鲫卵黄囊仔鱼阶段：本阶段试验选用的卵黄囊仔鱼为正常环境中孵化72h所得的仔鱼。根据预试验得到的结果，在18个用高锰酸钾消毒过的烧杯中加入受试液。每组放入50枚卵黄囊仔鱼。空白对照组五氯酚浓度为0，PCP1组五氯酚浓度为30μg/L，PCP2组五氯酚浓度为60μg/L，PCP3组五氯酚浓度为90μg/L，PCP4组五氯酚浓度为150μg/L，PCP5组五氯酚浓度为270μg/L。由于暂未查到相关实验红鲫卵黄囊阶段的毒性试验准则，则参考其他淡水鱼类卵黄囊仔鱼阶段的试验，本试验观察5天。

（3）试验中各阶段观察要求与各项观察指标

1）试验中的死亡标准

胚胎：无法观察到心脏跳动、无运动、呈不透明状态。

幼体：无呼吸、无心脏跳动、无运动、对刺激无任何反应。

2）胚胎试验阶段观察要求：在刚开始试验时，每隔半小时观察烧杯内情况，及时移走已死亡的胚胎。3h后每天在10：00观察一次胚胎的孵出和存活状态。

3）卵黄囊试验阶段观察要求：在试验正式开始后的24h、48h、72h、96h、120h观察卵黄囊仔鱼的生长发育状况，包括有无异常行为、是否畸形、是否死亡等基本状况，并做好记录。在试验各个阶段以及结束后用尺子对受试鱼的体长进行测量并记录。

（4）数据处理相关公式

（5）数据处理相关软件

本试验采用SPSS统计软件进行数据整理和分析。

3.试验结果

（1）五氯酚对实验红鲫胚胎发育的毒性试验

1）不同浓度的PCP对实验红鲫胚胎孵化率的影响

通过五氯酚对实验红鲫的毒性效应试验，结果显示随着五氯酚浓度增加，对实验红鲫胚胎的影响也越来越大。由表4-26可知，与空白对照组对比，10μg/L的PCP对实验红鲫胚胎的孵化产生了很大的影响，当PCP浓度为40μg/L时，近一半受精卵不能孵化。高浓度的五氯酚对胚胎孵出的数量影响最大，仅孵出少量的红鲫胚胎。由图4-6可知，空白对照组的孵化率接近百分之百，所以实验红鲫在正常的环境中生长，繁殖的成功率较大。胚胎孵化率与PCP浓度为负相关。当浓度≥10μg/L时，胚胎的孵化率均下降显著（P＜0.05），当五氯酚浓度为250μg/L时，下降最为显著（P＜0.01）。

表4-26　72h各组实验红鲫胚胎的孵化数量（）

注：空白组PCP的浓度为0，PCP1组的浓度为10μg/L、PCP2组的浓度为40μg/L、PCP3组的浓度为70μg/L、PCP4组的浓度为130μg/L、PCP5组的浓度为250μg/L。

图4-6　72h实验红鲫胚胎的孵化率

注：A为对照组，B为10μg/L五氯酚浓度组，C为40μg/L五氯酚浓度组，D为70μg/L五氯酚浓度组，E为130μg/L五氯酚浓度组，E为250μg/L五氯酚浓度组。*表示与空白对照组相比P＜0.05，**表示与空白对照组相比P＜0.01。

2）不同浓度的PCP对实验红鲫胚胎畸形率的影响

一般情况下试验红鲫的受精卵在72h左右就会孵出，我们选择了试验开始后72h为观察点。在此时期对照实验红鲫胚胎在空白组与五氯酚环境组中的状态，在显微镜下观察到一些畸形胚胎，表现为：与正常的胚胎有差异，身体各部分如脊柱、尾巴发生了弯折，而且行动也与正常的胚胎有所差异。由表4-27可知，实验红鲫在正常的环境下发生畸形的概率极低，在加有五氯酚的环境里，均有致畸作用产生。图4-7显示五氯酚对实验红鲫胚胎的致畸作用，且与环境中PCP浓度大小相关。相较于两个低浓度的环境，当五氯酚浓度达到70μg/L时，致畸作用已经非常严重。当浓度≥70μg/L时，胚胎畸形孵化率均增加显著（P＜0.05）；当五氯酚浓度为250μg/L时，增加最为显著（P＜0.01）。在试验的过程中我们及时把死亡的胚胎拿出来，可以观察到畸形的胚胎发生了如卵黄囊产生畸形、心包囊水肿的一些现象。

表4-27　72h各组实验红鲫胚胎的畸形数量（）

注：空白组PCP的浓度为0；PCP1组的浓度为10μg/L、PCP2组的浓度为40μg/L、PCP3组的浓度为70μg/L、PCP4组的浓度为130μg/L、PCP5组的浓度为250μg/L。

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图4-7　72h实验红鲫胚胎的畸形率

注：A为对照组，B为10μg/L五氯酚浓度组，C为40μg/L五氯酚浓度组，D为70μg/L五氯酚浓度组，E为130μg/L五氯酚浓度组，E为250μg/L五氯酚浓度组。*表示与空白对照组相比P＜0.05，**表示与空白对照组相比P＜0.01。

3）PCP对实验红鲫胚胎成活率的影响

表4-28显示试验进行到96h时，五氯酚对实验红鲫胚胎成活数量的影响。在正常环境下，空白对照组的胚胎成活率最大。低浓度（10μg/L）的PCP对红鲫的影响不大，五氯酚的浓度越来越大时，红鲫的成活数量越来越少。从图4-8可以看出，随着五氯酚浓度逐渐增大，胚胎成活率也相应减小。当浓度≥10μg/L时，胚胎的孵化率均下降显著（P＜0.05），当五氯酚浓度为250μg/L时，下降最为显著（P＜0.01）。所以五氯酚浓度与实验红鲫的成活率有很大的关系。

表4-28　96h各组实验红鲫胚胎的成活数量（）

注：空白组PCP的浓度为0，PCP1组的浓度为10μg/L、PCP2组的浓度为40μg/L、PCP3组的浓度为70μg/L、PCP4组的浓度为130μg/L、PCP5组的浓度为250μg/L。

图4-8　96h实验红鲫胚胎的成活率

注：A为对照组，B为10μg/L五氯酚浓度组，C为40μg/L五氯酚浓度组，D为70μg/L五氯酚浓度组，E为130μg/L五氯酚浓度组，E为250μg/L五氯酚浓度组。*表示与空白对照组相比P＜0.05，**表示与空白对照组相比P＜0.01。

（2）五氯酚对卵黄囊仔鱼的毒性试验

1）不同浓度的PCP对卵黄囊仔鱼死亡率的作用

根据表4-29、表4-30可知，PCP的浓度在30μg/L至60μg/L时对卵黄囊仔鱼的成活影响较小，仔鱼有死亡，死亡数量在24h最多，之后渐渐减少。PCP的浓度为90μg/L和150μg/L时，致死作用较大。而最大的浓度270μg/L的致死效果最明显，72h内该组的卵黄囊仔鱼已经全部死亡。

表4-29　各组浓度在不同时间段卵黄囊仔鱼的死亡数量（）

注：“－”表示为该组的卵黄囊仔鱼已经全部死亡，则相关数据不再做统计。

表4-30　各组浓度在不同时间段卵黄囊仔鱼的死亡率（）

注：“－”表示为该组的卵黄囊仔鱼已经全部死亡，则相关数据不再做统计。

2）不同浓度的PCP对卵黄囊仔鱼畸形率的作用

根据表4-31和表4-32可知，在正常环境中生长的胚胎基本没有发生畸形。PCP浓度分别为30μg/L、60μg/L、90μg/L的环境里，PCP的致畸作用一直持续。PCP浓度为270μg/L的环境中，卵黄囊仔鱼在24h时就已全部致畸。观察到五氯酚环境中的畸形卵黄囊仔鱼会发生一些异常行为，比如很急躁、没有规则地游动等。

表4-31　各组浓度在不同时间段畸形的卵黄囊仔鱼数量（）

表4-32　各组浓度在不同时间段卵黄囊仔鱼的畸形率（）

3）不同浓度的PCP对卵黄囊仔鱼生长的影响

据表4-33可知，正常环境中卵黄囊仔鱼发育正常。在试验的24～120h内，身体长度每天都会发生变化，在渐渐长大。PCP浓度为30μg/L时，卵黄囊仔鱼受到的影响较小，身体长度每天都有增加，但是明显没有达到同时间对照组中卵黄囊仔鱼的身体长度。在PCP浓度分别为60μg/L和90μg/L的环境中，PCP对卵黄囊仔鱼生长发育影响要大一些，仔鱼发育更加缓慢。在高浓度组150μg/L和270μg/L的环境中，卵黄囊仔鱼基本停止发育。所以五氯酚对实验红鲫卵黄囊仔鱼的生长发育具有一定的阻碍作用，延缓卵黄囊仔鱼的发育。

表4-33　各时间段卵黄囊仔鱼的身体长度值（）

注：“—”表示为该组的卵黄囊仔鱼已经全部死亡，则相关数据不再做统计。

4.讨论

PCP为剧毒农药，且是一种难降解的有机污染物，对水资源的污染危害极其严重，本次试验研究之前，就有很多学者对PCP进行过试验研究。有将PCP作用到稀有鲫胚胎的毒性效应研究，也有PCP与斑马鱼相关的研究。我国特有的本土鱼类实验红鲫，是一种很优良的实验鱼类，性成熟期早，繁殖能力超强，身体的颜色艳丽，有利于试验筛选和观察。目前已很普遍地应用到环境科学、药理学等一系列的研究领域中，特别是在水环境的重金属污染、农药杀虫剂污染的检测以及化学品环境管理方面等，但还没有发现PCP作用于实验红鲫的毒性研究。本次试验，以实验红鲫为受试鱼类，将实验红鲫胚胎的孵化率、成活率、畸形率以及卵黄囊仔鱼的死亡率、畸形率和生长发育状况作为观察指标，研究不同浓度的五氯酚对实验红鲫胚胎和卵黄囊仔鱼的毒性作用，以求实验红鲫作为指示生物研究五氯酚毒性的可行性。

根据本次试验结果可知，在实验红鲫胚胎发育阶段，五氯酚对它的孵化率、成活率都有影响。五氯酚浓度越大，实验红鲫胚胎的孵化率就会降低。五氯酚的浓度不断增大，实验红鲫胚胎的成活数量也会随之减小。同时很小浓度的五氯酚也会对实验红鲫胚胎带来致畸作用。从试验结果可知，自然环境下发育的胚胎也有畸形的产生，这可能与胚胎发育的个体差异有关。同时在显微镜的观察下发现了畸形胚胎有心包囊水肿现象，这说明五氯酚对实验红鲫胚胎中的血液循环会产生影响。在卵黄囊仔鱼阶段，五氯酚也能够影响仔鱼的生长发育，浓度越高的五氯酚会让卵黄囊仔鱼的存活率降低，延缓卵黄囊仔鱼的生长发育，影响仔鱼的行为，也会导致仔鱼发生畸形变异，这一影响作用在斑马鱼作为受试鱼类的PCP毒性试验中也有体现。本试验可为以后鱼类在胚胎以及卵黄囊仔鱼阶段的毒性试验提供参考。

本次试验研究只用了五氯酚一种化学品，探究其对实验红鲫胚胎以及卵黄囊仔鱼的毒性作用。在现实生活中，污染水资源的污染物有很多，除了本次试验研究的五氯酚之外还有其他的化学品。根据研究显示，重金属污染物作用于实验红鲫后也会产生非常明显的毒理学效应，它能够在水中累积，并危害到其他生物，所以近年来也受到了人们的关注。在今后的研究中，可以探究一下多种污染物对鱼类的联合毒性作用。本次试验仅研究了五氯酚作用于实验红鲫的毒性作用，并未深入地探究五氯酚毒性的作用机制，今后可以加强这方面的研究。

5.结论

（1）五氯酚对实验红鲫的胚胎发育会造成致死、致畸的毒性作用，还会导致胚胎孵化率下降；会延缓卵黄囊仔鱼的发育，也会造成致死、致畸的毒性作用。当浓度达到270μg/L时，会停止发育；同时PCP会扰乱卵黄囊仔鱼的正常行为。

（2）使用实验红鲫作为评价五氯酚化学环境的受试鱼类具有一定的可操作性，为今后研究五氯酚的毒理机制提供参考，为制定检测五氯酚在水质中的含量以及评价水质环境提供科学根据；更加深入地了解和探究实验红鲫应用到化学品环境评价的具体操作过程，为实验红鲫应用到毒理试验中的可行性提供了试验依据。