甲苯对实验红鲫血红细胞的影响研究

微核检测技术是有毒物质（如甲苯及苯衍生物、除草剂、放射性物质等）对生物细胞遗传损伤检测的一个非常有用的方法。有人用鱼类微核试验法评价水载污染及鱼类的毒性效应，认为鱼类微核率可以迅速可靠地反映出机体染色体损伤、DNA复制紊乱等异常状况。

在现代工业高速发展的今天，甲苯及苯衍生物对水的污染也日渐加重，研究甲苯对红鲫鱼的毒理作用，对水环境的监督，对保护人类自身有着重要意义。

1.试验目的

为研究甲苯对实验红鲫血红细胞微核和核异常的影响，进行微核试验，并对试验数据进行分析和评估，以评价实验红鲫作为甲苯污染的指示动物可行性和优越性。

2.实验动物

实验红鲫C1HD系是南华大学吴端生等采用人工雌核发育技术培育的一种鱼类近交系。它作为实验动物具有体形适当、体色全红、繁殖力强、易饲养等优点，特别适合于作为急性毒性实验、化学品毒性检测、重金属污染和农药杀虫剂污染监测等的实验鱼类。

3.试验方法

（1）驯养

将红鲫鱼放在试验用的水族箱中在事先暴气48h的自来水中驯养1周，使鱼适应试验环境。配制甲苯溶液：根据前期试验将甲苯浓度设置为4mg/L、8mg/L和12mg/L三个浓度。

（2）染毒

将100条红鲫鱼随机分为高、中、低、对照组四组，每组25条，置一水族箱中，染毒组分别按12mg/kg、8mg/kg、4mg/kg（体质量）腹腔注射（从红鲫鱼胸鳍下无鳞片处小心将药水推注入鱼的腹腔中）不同浓度的甲苯溶液，对照组注射0.2mL 0.85%生理盐水。分别于1、3、5、7天取血制片观察，计数。

（3）取血制片

甲醇固定，瑞氏染色，缓冲液冲洗，晾干后在显微镜下观察，计数和测定：将血涂片置于油镜下观察、计数，每张涂片至少数40个红细胞，分别记录微核数、微核细胞数、双核数、小核数、无核数、其他核异常数、总异常数，结果以百分率表示。其中，微核为圆形或椭圆形，直径为主核的1/5～1/4；其他核异常包括核质外凸、核质内凹、核质断裂、核位置明显异常等；总核异常数包括微核数、双核数、小核数、无核数，其他核异常数。

4.试验结果与分析

（1）甲苯对实验红鲫血红细胞微核及核异常的影响

分别染毒后，试验组红鲫鱼活力下降，但未出现死亡。随着甲苯浓度的增加及时间的延长，核异常率也明显发生变化，结果见表4-22～表4-25。

表4-22　染毒1天后对红鲫鱼血红细胞微核和核异常的影响

表4-23　染毒3天后对红鲫鱼血红细胞微核和核异常的影响

表4-24　染毒5天后对红鲫鱼血红细胞微核和核异常的影响

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表4-25　染毒7天后对红鲫鱼血红细胞微核和核异常的影响

图4-3　染毒对红鲫鱼血红细胞微核的影响

图4-4　染毒对红鲫血红细胞核异常的影响

图4-5　染毒对红鲫血红细胞总核异常数的影响

（2）结果分析

从表4-22至表4-25与图4-3至图4-5中可知：甲苯对红鲫鱼外周血红细胞的微核率，核异常率及总核异常率是具有一定影响的。

1）微核率、核异常率与总核异常率都明显上升：不同的甲苯浓度处理相同时间或同一浓度处理不同时间后，红鲫鱼的微核率、核异常率与总核异常率都明显上升，明显高于生理盐水对照组的水平（表4-22至表4-25）。从图4-3至图4-5可以看出，红鲫鱼微核率、核异常率与总核异常率均出现一个高峰，但并不一致，各种浓度组核异常率高峰均在第七天（图4-4）。出现高峰的浓度值也不是完全同步的。这种现象的出现可能是由于甲苯影响红鲫鱼的途径很多，抑制纺锤体而产生核异常和使微小核物质滞留质核外的时间、程度并不一致所致。

2）具有一定的剂量效应：在处理时间相同的不同甲苯浓度组中，均以最高浓度组上升最多。图4-3至图4-5显示，在处理第一天、第三天和第五天的各浓度中，均以12mg/kg组上升最多，说明浓度越高对红鲫鱼的毒害越大。图4-3显示，高浓度组第三天的微核率较第一天有所下降，可能原因为试验的失误或取材红鲫鱼的个体差异所致。图4-4显示，第七天高浓度组的核异常率都有下降而中低浓度组继续上升，分析原因一方面可能是红鲫鱼的个体差异所致，另一方面也显示红鲫鱼对甲苯的毒害产生了一定的抵抗力。

3）具有一定的时间效应：表4-22至表4-25显示，用同一甲苯浓度处理不同时间的各组比较中发现，每一浓度组中，随着染毒时间的加长，红鲫鱼的血红细胞微核率均有不同程度的上升。但图4-4显示，在4mg/kg与12mg/kg浓度组中，5～7天的核异常率有所下降，此现象说明红鲫鱼对甲苯的毒害作用有一定的抵抗力，经过一段时间以后，通过自身的调节，排除有害物质、减小毒害并且抑制核异常的产生。

5.讨论

随着工农业的迅速发展，大量的甲苯及苯衍生物元素也随着废弃物进入水体，不仅严重污染了水体环境，同时对水体中的主要动物——鱼类，也产生了非常严重的危害。鱼类又是人类重要的食物来源，这些受毒害的鱼必将通过食物链而最终危害人类自身。

甲苯及苯衍生物进入动物体内后，具有较为强烈的致突变、致畸和致癌作用，同时又因为甲苯及苯衍生物具有难以被生物分解和较高的富集等特性，当环境中甲苯及苯衍生物的含量超过一定浓度时，如果长期生活在这样的环境中，就会对包括人类在内的所有生物造成极大的毒害作用。

微核试验是染色体损伤短期突变性试验方法之一，于20世纪70年代初由Matter和Schmide建立。有关微核的产生原因，不同的学者虽有不同的表述，但是意见基本上是一致的，即微核是细胞在有丝分裂时因为各种有害因素的损伤，使细胞核残留在核外的微小染色质块，一般认为无着丝粒断片可形成小微核，纺锤体断裂造成的一条或一组染色体滞后可形成大微核。由于微核与染色质的突变具有较为密切的联系，所以长期以来微核被许多科研工作者用来作为评价毒物、放射性物质以及细胞毒性物质对人、动物及体外细胞损伤的指标。现在微核检测技术是检测有毒物质对生物细胞遗传操作的一个非常有用的指标，微核率可以迅速、可靠地反映机体染色体操作及DNA复制紊乱等异常状况。

6.结论

（1）甲苯及苯衍生物对实验红鲫具有一定的遗传毒性，能对红鲫血红细胞微核率、核异常率和总核异常率产生较大的影响。

（2）实验红鲫作为模式动物用于水环境污染物检测和化学品毒性试验是可行的。