菌种为槐栓菌（Trametes robiniphila murr），取自郑州轻工业学院食品与生物工程学院烟草与微生物实验室。称取6g乳糖、0.6g酵母粉放入500mL锥形瓶，加入200mL蒸馏水配制液体培养基，灭菌，以3%的接种量接种到液体培养基中，130r/min、28℃条件下培养6d，真空抽滤分离菌丝体和发酵液。发酵液旋转蒸发至25mL后加入100mL无水乙醇于4℃下过夜，1000r/min离心15min获得粗胞外多糖；用Sevag法对粗胞外多糖去除蛋白，加入1/4体积的除蛋白液（氯仿∶正丁醇＝4∶1），与粗胞外多糖充分混匀，静止，弃中层与下层，取上层，直至不再出现蛋白层，获得精制胞外多糖。
精确称取胞外多糖80mg，用4mL 0.2mol/L NaCl溶液溶解，过0.45μm滤膜；取2～3mL胞外多糖溶液上Sepharose CL－6B柱，以0.2mol/L NaCl作为缓冲液洗脱并分管收集，用可见光紫外分光光度计检测各收集管中收集液，在波长280nm处读取吸光度，检测各收集管中蛋白浓度，采用硫酸－苯酚法测各收集管中的胞外多糖含量，在波长490nm处读取吸光度，检测多糖浓度。以收集管号为横坐标，分别以490nm、280nm的吸光度为纵坐标作图（图11.1）。由图11.1可见，槐栓菌EPS经过Sepharose CL－6B柱收集，第25管至第45管分离获得一个胞外多糖组分，即达到纯化胞外多糖的效果。将过柱后的收集液浓缩至50mL，透析（透析袋截流分子质量8000～14000ku）除去NaCl，冷冻干燥，获得精制胞外多糖，备用。
图11.1 槐栓菌胞外多糖纯化
红外分析取1～2mg精制胞外多糖，取100～200mg溴化钾（KBr）压片，在4000～400cm－1区间内用TENSOR 27傅里叶变换红外光谱仪扫描IR吸收。槐栓菌EPS的IR图谱见图11.2。
槐栓菌EPS的IR图谱数据分析见表11.1。
图11.2 槐栓菌精制胞外多糖IR图谱
表11.1 槐栓菌精制胞外多糖IR图谱分析(www.xing528.com)
红外结果显示，槐栓菌精制胞外多糖在3280cm－1处有一个很宽的红外吸收峰，存在O—H的伸缩振动，酰化或醚化后，这组峰会消失，因这组峰在3400cm－1以下，由此可以断定存在分子间氢键为主；在2930cm－1处出现的红外吸收峰为糖类特征峰；在1630cm－1处出现红外吸收峰为酰胺基的N—H变角振动，因此此糖含有酰胺基；1410cm－1处是—COOH中C—O间的伸缩振动；1370cm－1处振动为官能团—COO的C═O的对称伸缩振动；而1130cm－1处的吸收峰为环内醚结构中C—O伸缩振动，说明该糖有环内醚结构；880cm－1处的红外吸收峰说明该糖存在β－糖苷键，为β－型糖；780cm－1处的红外吸收峰有说明该糖为吡喃糖，并且有环结构。
槐栓菌EPS的气相质谱联用（GC/MS）分析：精确称取精制胞外多糖0.005g，装入棕色瓶中，加入3mL 2mol/L三氟乙酸，密封后，121℃静置2h。取出棕色瓶，待冷却后，过0.22μm水相滤膜，旋转蒸发将液相蒸干；加入2mL甲醇（分析纯），旋干，重复3次。依次加入1mL吡啶和1mL三甲基氯硅烷，密封，80℃恒温2h。取出棕色瓶，待冷却后过0.22μm尼龙膜，滤液加入到气相瓶。以鼠李糖、核糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、麦芽糖、葡萄糖为标准样，检测其GC/MS出峰时间，为单糖糖基标准峰。
气相条件：HP－5 MS 60m色谱柱；升温程序为起始温度80℃，以5℃/min的速度升温至280℃，保持20min；进样量1μL，分流比5∶1，延迟时间10min，进样口280℃，传输线280℃。
使用Xcalibur分析软件，参照标准品的峰值，测定槐栓菌EPS单糖组分如表11.2所示。乳糖可提供葡萄糖基和半乳糖基，以乳糖为碳源发酵槐栓菌，获得的槐栓菌EPS的单糖组成中葡萄糖基含量高达52.47%，而并不含有半乳糖基（表11.2），说明菌体可直接利用葡萄糖基，而不能直接利用半乳糖基，在发酵过程中可能将半乳糖基转换为葡萄糖基、核糖基、阿拉伯糖基及甘露糖基进行代谢，这与Kai等研究结果相符。
表11.2 槐栓菌EPS的单糖组成
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