真菌胞外多糖的硫酸化修饰与结构分析

本部分采用精制真菌多糖得出最优化的反应条件。固定多糖羟基与氯磺酸的摩尔比为1∶5，分别以二甲基亚砜（DMSO）、N，N－二甲基甲酰胺（DMF）或吡啶（pyridine）为溶剂，反应温度（T）为60℃和80℃，反应时间为60min、90min、120min，得到一系列产物。反应结束后，待反应液冷却至室温后，将其倒入100mL冰水混合物中，用15%的NaOH溶液调整反应液的pH＝7.0，加入3倍于反应液体积的无水乙醇，静置24h后离心得到沉淀，用热蒸馏水将其溶解，用蒸馏水透析72h，浓缩后真空冷冻干燥后，得到真菌发酵胞外多糖硫酸酯。它们的具体反应条件以及硫酸酯化取代度、分子质量和水溶性列于表5.1。其中以DMSO为溶剂的硫酸酯化反应所得产物产率低，且水溶性差；而以DMF和吡啶为溶剂均可得到水溶性好、含硫量高的硫酸酯衍生物。在其他反应条件相同时，以吡啶为反应溶剂所得产物的分子质量优于在DMF中的酯化反应。此外，升高反应温度、延长反应时间均可使产物取代度增加，但同时由于高分子降解，所得硫酸酯衍生物分子质量越小。因此，采用吡啶为反应溶剂，羟基与氯磺酸的摩尔比为1∶5，且反应温度为80℃、反应时间90min的条件，可以得到分子质量较高、水溶性良好且具有较理想取代度的硫酸酯衍生物。

表5.1 杏鲍菇胞外多糖（Fr－Ⅰ）在不同反应条件下的分子质量、硫酸酯化取代度和水溶性

化学结构分析包括以下方法：

1.硫酸基含量的测定

采用BaSO₄浊度法。

2.红外光谱测定

分别取杏鲍菇发酵胞外多糖及其硫酸酯样品各1mg，加入一定量KBr粉末，一起研磨均匀后进行压片处理，于4000～500cm^－1的红外区进行扫描，得到其红外光谱图。

3.黏度法测量

杏鲍菇胞外多糖及其硫酸酯衍生物的特性黏数（［η］）用乌氏毛细管黏度计于25℃测量，溶剂为0.15mol/L NaCl水溶液即0.9% NaCl。忽略动能校正及溶液和溶剂的密度差值。按以下的Huggins和Kraemer方程由外推浓度c至零计算［η］：

其中，k′和β为聚合物在某温度下某溶剂中的常数，η_sp/c为比浓黏度，（lnη_r）/c为比浓对数黏度。(www.xing528.com)

4.尺寸排除色谱和光散射仪联用（SEC－LLS）

采用尺寸排除色谱和光散射仪联用装置（SEC－LLS）测定试样的重均分子质量（M_w）、均方根旋转半径（＜s²＞_z^1/2）及多分散系数（M_w/M_n）。激光光散射仪为美国Wyatt技术公司DAWN^®DSP多角度激光光散射仪，波长为633nm。真菌多糖及其硫酸酯衍生物溶于0.15mol/L NaCl水溶液中，分别配制其浓度为2mg/mL，搅拌24h使其充分溶解。测量前溶液和溶剂都经过光学纯化［用0.25μm滤膜过滤（PTFE，Puradisc 13－mm Syringe Filters，Whatman，England）］。流动相为0.15mol/L NaCl水溶液（用0.25μm滤膜过滤除尘，并且用超声发生器脱气）。测试温度25℃，进样量100μL，流速0.6mL/min。示差折光指数增量（d_n/d_c）用示差折光仪（OptilabT－rEX，Wyatt Technology Co.，SantaBarbara，CA，USA）于633nm和25℃测量。真菌多糖及其硫酸酯衍生在0.15mol/L NaCl水溶液中的dn/dc值分别为0.138mL/g。Astra软件（Version 4.72）用于散射信号采集和数据分析。

图5.1 杏鲍菇胞外多糖及其硫酸酯红外光谱图

对杏鲍菇多糖及其硫酸酯衍生物的FTIR光谱示如图5.1所示。杏鲍菇多糖的红外谱图在1250cm^－1、1400cm^－1、1650cm^－1和3400cm^－1处显示多糖特征吸收峰。与未取代的杏鲍菇多糖相比，硫酸酯衍生物的FTIR光谱在1260cm^－1和820cm^－1处出现了两个新吸收峰，它们分别对应于S═O不对称伸缩振动和C—O—S对称振动吸收峰，由此表明已成功合成出硫酸酯衍生物。

多糖的生物功能基本都需要在溶液环境中实现，所以研究其在水溶液中的分子构象对于弄清其生物功能的作用机制具有深远意义。在各种生物活性的测试中，生理盐水（0.9% NaCl水溶液）作为一种生理介质广泛使用。因此，我们选择生理盐水体系为溶剂，研究杏鲍菇多糖及其硫酸酯衍生物在该水体系中的重均分子质量（M_w）、均方根旋转半径（R_g）、多分散系数（M_w/M_n）等分子参数。结果如表5.2所示，杏鲍菇多糖在衍生化之后分子质量大大降低，从85万降至32.2万，但是分子尺寸却有所增加，从23.2nm增加到52nm，黏度也略增加。分子质量的降低说明，衍生化的过程中多糖分子发生了降解，导致分子链部分断开。但是分子链断开之后，分子尺寸却有所增加，说明多糖在衍生化之后，分子链在盐水溶液中更加舒展，链段由原来较为致密的结构打开导致分子尺寸增加，链段的舒展也导致了多糖溶液黏度增加。多分散系数增加，也说明了多糖在衍生化之后发生断链导致分散程度增加，分子质量分布更广，示意图如图5.2所示。

表5.2 杏鲍菇多糖及其硫酸酯衍生物在0.1mol/L NaCl水溶液中的分子参数以及硫酸酯衍生物的取代度

注：M_w指重均分子量，指均方根旋转半径，［η］指黏度，硫含量指硫酸基含量，DS指硫酸根取代度。

图5.2 硫酸酯化诱导的Fr－1到SF－1的构象转变示意图