本工作采取的结构分析方法包括IR，NMR，GC－MS。IR可以初步鉴定样品的性质，并可提供多糖糖苷键方面的信息；NMR对于多糖的结构具有重要作用，其基本信息（异头碳构型，支链等）均可得到归属；GC－MS能提供组成多糖分子的单糖类别及其摩尔比，通过以上分析方法与实验方法结合可确定多糖的结构。
（1）红外光谱（IR）检测 红外光谱（IR）测试使用Nicolet傅立叶变换红外光谱仪（Spectrum One，Thermo Nicolet Co.，Madison，WI，USA），采用KBr压片法，扫描范围为4000～500cm－1。
核磁共振：13C NMR谱600MHz INOVA－600型核磁共振仪（Varian Inc.，Palo alto，CA，USA）测试。以99.96% DMSO－d6为溶剂，多糖溶液浓度约为2wt%，丙酮作内标（δH＝2.225，δC＝31.45），化学位移用单位mg/kg表示。
（2）气相色谱与质谱联用（GC－MS）测单糖组分 准确称取5mg多糖样品溶于3mL 2mol/L的三氟乙酸溶液，密封后120℃下水解2h。水解后旋蒸，蒸干后加入2mL甲醇继续蒸干，重复3次（去除三氟乙酸）。加入2mL吡啶和100mL硅烷化衍生试剂（BSTFA∶TMCA，99∶1）于80℃烘箱反应1h，用0.22μm滤膜过滤至气相瓶中送样检测。
气相色谱设定条件：自动进样1μL，分流比例5∶1，延迟时间10min，采用HP－5 MS 60m色谱柱，初始温度为80℃，然后以5℃/min的速率升至280℃，保持该温度20min。使用装有火焰离子化检测器的气相色谱仪（HP－6890，Agilent）、毛细管色谱柱（30m×0.32mm×0.25μm HP－5MS）和质谱仪（5973N，Agilent）可准确地分析试样中的单糖组成和键接方式。
热水及碱液提取的两种水溶性多糖的红外光谱图示见图4.2。红外谱图显示出多糖在红外光谱图中的特征性吸收峰，比如：3330cm－1左右是由多糖中缔合的羟基O—H伸缩振动引起的，有较宽的吸收峰；2940cm－1处吸收峰是由糖链C—H的伸缩振动引起的；1620cm－1处吸收峰是—COO－的非对称伸缩振动；1300～1000cm－1为多糖中C—O—C的伸缩振动吸收峰。800cm－1到1000cm－1为判断多糖结构的特征区间，例如，890cm－1处的吸收峰为β－吡喃环糖苷键的特征峰，而920cm－1和850cm－1是α－吡喃环糖苷键的特征峰；810cm－1和870cm－1是甘露糖的特征吸收峰。从图中可以看出水提多糖在此区间显示出较为复杂的吸收峰带，其中既有甘露糖也有α－吡喃环糖苷键的特征吸收峰，而碱提多糖在890cm－1有明显吸收，它是β－吡喃环糖苷键的特征峰，在890cm－1两侧也无甘露糖的吸收峰，表明碱提多糖的主要化学结构可能为β－D－葡聚糖。
图4.2 热水及碱提杨树桑黄多糖红外吸收峰
（3）气相色谱与质谱联用（GC－MS）为得到更加详细的多糖化学结构信息，一般采用化学分析方法将多糖降解并使用GC－MS作为检测工具。我们将多糖样水解、硅烷化，然后进行气相色谱分析，可得到多糖的单糖组成。如图4.3所示了来自两种多糖的硅烷化分析的GC/MS的总离子流（TIC）色谱图。如表4.1所示，与标准单糖衍生物（数据未示出）相比，除少量甘露糖外，PV－B主要由葡萄糖组成，表明来自氢氧化钠溶液提取程序的多糖几乎是纯葡聚糖。然而，P V－W由52.2%的甘露糖、29%的葡萄糖和少量的其他单糖组成，表明来自热水提取的多糖具有更复杂的结构。
表4.1 多糖中单糖的相对含量 单位：%
图4.3 热水及碱提桑黄多糖硅烷化分析的GC－MS总离子流（TIC）色谱图
P V－W和P V－B在DMSO－d6中的13C NMR谱图如图4.4所示。显然，PV－B的13C NMR谱和具有（1→6）侧链的β－（1→3）－D－葡聚糖结构非常相似，例如裂褶菌多糖和香菇多糖。其中103.7（C1），73.9（C2），86.9（C3），68.9（C4），76.6－77.3（C5）和61.4（C6）mg/kg的峰是β－（1→3）－D－葡聚糖的典型特征，而70.5（C6s）mg/kg的峰是由主链上的分支影响引起的，这表明葡聚糖在C6处有分支。对于PV－W，将101.3，79.8，72.3，66.7和61.9的峰可归属于β－D－甘露糖的C－1，C－5，C－3，C－4和C－6。102.1，74.1，68.9，79.8和61.9的信号可归为β－1，3－D－葡萄糖的C－1，C－2，C－4，C－5和C－6。99.4处的信号表明PV－W也具有α－连接的甘露糖，67.9～71.09的信号由多糖支化结构引起。根据上述所有日期，P V－B被证实为β－1，3－D－葡聚糖，其分子为β－1，6－D－葡萄糖，PV－W为杂多糖，具有α－甘露糖，β－D－甘露糖和β－D－葡萄糖。(www.xing528.com)
图4.4 热水及碱提杨树桑黄多糖核磁图谱
链构象分析方法 采用尺寸排除色谱、多角度激光光散射仪和示差折光仪联用装置（SEC－MALLS－RI）测试试样的重均分子质量（Mw）、均方根旋转半径（＜S2＞z1/2）及多分散系数（Mw/Mn）等分子参数。多角度激光光散射仪为美国怀亚特技术公司多角度激光光散射仪（MALLS，Wyatt Technology Co.，Santa Barbara，CA，USA），激光为He－Ne激光源，波长设置为663.7nm，用甲苯对激光光散射仪进行校正，用普鲁兰标样（pullulan，Mw＝1.18×104，Mw/Mn＝1.10，Showa Denko，Japan）进行归一化处理。多糖溶于超纯水中，配制浓度为1mg/mL，室温下磁力搅拌24h使其充分溶解。测量前溶液和溶剂用滤膜过滤（Millipore，0.2μm）。流动相分别为使用50mmol/L NaNO3和0.02% NaN3（用0.2μm滤膜过滤除尘后超声脱泡4h），测试温度25℃，进样量100μL，流速0.5mL/min。多糖在水溶液中的dn/dc值由示差检测器测量五个不同浓度多糖样品，计算结果为0.138mL/g。Astra软件（Version 6.1）用于多糖溶液的示差、激光散射信号采集并求取Mw、＜S2＞z1/2和第二维利系数（A2）等分子参数。
多糖溶液特性黏数（［η］）用乌氏毛细管黏度计于25℃下测量。溶剂分别为二次蒸馏水水溶液和二甲亚砜（DMSO）。选择溶剂流出毛细管时间适当长（t0＞120s）的黏度计，因此可忽略动能校正。用逐步稀释法将浓度（c）外推至零，由Huggins方程和Kraemer方程的截距得到［η］，其中，k′为高分子在某温度下某溶剂中的常数，ηsp/c为比浓黏度。
Huggins式
Kraemer式
PV－W和PV－B在水中的分子质量和链构象用尺寸排阻色谱结合多角度激光散射（SEC－MALLS）和Ubbelohde毛细管黏度计测定。结果如表2所示，根据等式（1）和（2）估算水中两个样品的Huggins常数k′和特性黏度［η］。对于良溶剂中的聚合物，k′值通常为0.3～0.5，对于θ溶剂中的聚合物，其值为0.5～0.8。PV－W的k′值为0.41，PV－B的k′值分别为0.37，表明它们可以较好地分散溶于水中而不会聚集。如图4.5所示多糖的光散射信号和分子质量对应流出时间的SEC图谱。结果证实PV－W和PV－B均为单一级分，随着流出时间的增加，多糖分子质量逐渐下降。如表2所示，PV－W和PV－B的平均分子质量（Mw）分别测定为4.6×105和5.3×105。特性黏度［η］值和均方根旋转半径＜s2＞z1/2值反映了聚合物链的扩展程度。通常，线性链聚合物具有比支化聚合物更高的［η］值和＜s2＞z1/2值。尽管PV－W和PV－B具有相似的分子质量，PV－B的半径＜s2＞z1/2值和［η］远远高于PV－W，说明PV－W可能会支化度较高的高聚物，而PV－B的支化度远低于PV－W，更偏向为线性链聚合物。为了进一步探讨两种多糖分子构象，我们可以对＜s2＞z1/2与Mw进行曲线拟合，由拟合结果可以建立Mw与〈s2〉z1/2的关系式（〈s2〉z1/2＝kMwα）。其中α值可以作为判断多糖分子在水溶液中的构象。通常，α为0.3左右表明球型高分子，无规卷曲的柔顺链高分子在良溶剂中的指数α值为0.5～0.6，刚性链或蠕虫状链的α值大于0.6，可以看出随着α值的增加，高分子链的舒展性越高。
图4.5 热水及碱提杨树桑黄多糖SEC图谱
两种多糖（PI－W和PI－B）的Mw与〈s2〉z1/2散点分布图如图4.6所示，我们分别对两种多糖进行模拟。正如预期的那样，从图中可以观察到两条具有不同斜率的模拟曲线，表明PV－W和PV－B具有不同的构象。PV－W的α＝0.29，表明PV－W是稳定的球状聚合物，而PV－B的α＝0.57表明PV－B是水溶液中的无规卷曲构象。因此，结果表明PV－B的链结构比PV－W的链结构更灵活和扩展。
表4.2
图4.6 热水及碱提杨树桑黄多糖（PI－W和PI－B）的Mw与〈s2〉z1/2对数关系图
免责声明：以上内容源自网络，版权归原作者所有，如有侵犯您的原创版权请告知，我们将尽快删除相关内容。
