本工作以在不同搅拌方式下血红密孔菌液体深层发酵所产的胞外多糖为研究对象。通过单因素实验和统计学方法优化了生产胞外多糖（exopo-lysacchride，EPS）的最佳发酵条件，结果表明血红密孔菌最佳培养时间为8d，最佳碳氮源分别为葡萄糖和大豆粉。研究了发酵过程中菌丝体的产量及形态学变化，在真菌搅拌式发酵罐条件下血红密孔菌产EPS的量高于气升式发酵罐；在形态学方面，随着培养时间的增加，气升式发酵罐中菌丝球的平均直径和粗糙度高于搅拌式发酵罐，而圆度和紧密度低于搅拌罐。通过使用凝胶层析、气相色谱仪、红外光谱仪、热重分析仪和刚果红实验对不同搅拌方式下所得胞外多糖分进行了初步分子表征；血红密孔菌搅拌罐和气升罐胞外多糖均为单组分多糖，分子质量分别为462.97ku和54.999ku，均为含有葡萄糖和甘露糖的酸性β－吡喃糖，主要单糖组成分别为甘露糖∶葡萄糖∶半乳糖＝3.41∶2.41∶1和葡糖糖∶甘露糖∶半乳糖＝30.98∶1.50∶1，降解温度分别为152℃和116℃，空间构象均为无规则卷曲。采用水杨酸法和DP P H法测定胞外多糖的抗氧化活性，随着血红密孔菌胞外多糖浓度的增加，其对·OH和·DPPH的清除能力呈增大趋势，且搅拌罐胞外多糖对· OH和· DP P H的清除率高于气升罐胞外多糖的清除率。
本工作采用实验室常用的摇瓶培养法，由于其发酵体积小，可用于最佳培养时间和培养基成分的优化，为后期大规模的发酵罐生产奠定基础。优化过程如下：
（1）种子的制备 将冰箱保存的菌株转接到PDA平板上，26℃恒温培养8d。使用打孔器，在平板上靠近菌株生长边缘的位置取两块0.5cm2、长满新生菌丝的接种块，接种于基础培养基中。将锥形瓶放入摇床，于26℃、160r/min条件下培养4d后取出，加入灭菌的磁珠和适量玻璃珠，用磁力搅拌器搅拌2h，将培养物打碎，即可将其作为种子接种，接种量为4%。
（2）最适培养时间的确定 使用基础培养基接种培养，定期抽取培养物（每隔2d取一次），测定其菌丝产量和EPS产量，分别平行3次取平均值，确定其最佳培养时间。
（3）单因素实验确定最佳培养条件 用蔗糖、果糖、麦芽糖、木糖、山梨醇和乳糖分别替代基础培养基中的葡萄糖，经接种培养后，每个实验组平行3次，测定各个锥形瓶中的菌丝产量和EPS产量。
用NaNO3、尿素、胰蛋白胨、多价胨、酵母粉、大豆粉、玉米粉和蛋白胨分别替代基础培养基中的蛋白胨，经接种培养后，每个实验组平行3次，测定各个锥形瓶中的菌丝产量和EPS产量（采用苯酚硫酸法）。
不同培养时间内，血红密孔菌菌丝干重和EPS产量的变化见图1.1，第8天EPS产量达到最高为1.31g/L，菌丝干重整体变化不明显。所以，最终确定最佳培养时间为8d。
图1.1 血红密孔菌菌丝干重和EPS产量随培养时间的变化
（■菌丝干重，●EPS产量）
血红密孔菌碳氮源优化结果见图1.2。结果表明，碳源对血红密孔菌菌丝干重有一定的影响，对EPS的产量影响较小［图1.2（1）］，综合考虑，在以后的试验中将选用葡萄糖为最佳碳源；菌丝干重和EPS产量分别在使用酵母粉和大豆粉时达到最大［图1.2（2）］，最终选择了大豆粉作为最佳氮源进行后续试验；因此，可确定两个影响血红密孔菌EPS产量的主要因素：葡萄糖和大豆粉。
图1.2 不同培养基成分对血红密孔菌菌丝干重和EPS产量的影响
（■菌丝干重，●EPS产量）
本工作对不同搅拌方式下（机械搅拌和气升罐），血红密孔菌胞外多糖的产量进行了检测，还对发酵过程中菌丝球的各种形态学参数进行了分析。
发酵罐发酵：5L的发酵罐装入优化培养基3.5L，离位灭菌后冷却、接种。设置发酵罐控制参数：温度26℃，搅拌速度160r/min，进气量2vvm。自接种开始，每隔48h取样一次。
样品的处理流程见图1.3。
如图1.4所示，搅拌罐中EPS产量高于气升罐产量。搅拌罐发酵液中EPS产量随着培养时间的延长而增加，第4天后开始下降，而气升罐EPS产量从第2天就开始下降。采用DT2000图像分析软件分析不同搅拌方式下不同发酵时间菌丝球各形态参数的变化，其中，紧密度＝菌核面积/菌丝球面积；粗糙度＝（菌丝球的周长）2/（面积×4π）。
图1.3 发酵罐样品处理流程
不同发酵时间菌丝球形态变 化 见 图1.5，采 用DT2000 图像分析软件分析不同搅拌方式在不同发酵时间菌丝球的性状，见图1.6。如图1.5所示的图片可以看到，搅拌式发酵罐和气升式发酵罐发酵生产胞外多糖时菌丝球形态明显不同。搅拌罐菌丝球在第3天已有较明显的菌核，到第4天菌核外的部分变得稀薄，到第5天菌丝球外围菌丝被搅拌罐产生的剪切力打散，只剩菌核。而气升罐在第4天时发现有明显的菌核，从第1至4天内菌丝球外围菌丝相互纠缠，第6天较为蓬松，到第8天时外围菌丝过度蓬松，且相互缠绕。总体来说，在培养初期搅拌罐菌丝球平均直径略大于气升罐，但到培养中后期气升罐菌丝球体积明显大于搅拌罐中的菌丝球［图1.6（1）］。搅拌罐和气升罐菌丝球紧密度变化均不规则，呈先增加后下降再增加的趋势［图1.6（3）］。搅拌罐和气升罐中菌丝球的圆度和粗糙度变化基本一致，圆度急剧下降后略有升高［图1.6（2）］，粗糙度先增加后略有下降［图1.6（4）］，气升罐培养初期稍有波动。
图1.4 血红密孔菌EPS产量的变化
（●搅拌罐，〇气升罐）
图1.5 血红密孔菌菌丝球形态随时间的变化
图1.6 血红密孔菌菌丝球各形态参数随时间的变化
（●搅拌罐，〇气升罐）
小结
通过发酵罐、显微拍摄和其他实验室常用仪器研究了不同搅拌方式下血红密孔菌EPS产量和形态学参数变化。经发酵罐扩大培养发现，在真菌搅拌式发酵罐条件下血红密孔菌EPS产量高于气升式发酵罐；在形态学方面，随着培养时间的增加，气升式发酵罐中菌丝球的平均直径和粗糙度高于搅拌式发酵罐，而圆度和紧密度低于搅拌罐。这是因为不同的搅拌方式能较大程度影响菌株的生长，从而影响到了发酵罐内的传质和传热过程，致使菌丝体的代谢和形态等均受到影响，进而影响到发酵罐的控制和调节。因此，选择不同类型的发酵罐对菌株的生长代谢以及最终产物的获得均有较大的影响。
（1）发酵完成后离心去除菌丝体等，将所得发酵液水相浓缩，加入4倍体积的无水乙醇沉降过夜，离心取沉淀，并将其冷冻干燥，即得粗多糖。
（2）Sevage法除蛋白，将胞外多糖溶于适量蒸馏水，加入1/3多糖溶液体积的氯仿/正丁醇（5∶1）混合液，磁力搅拌0.5h，离心取水相；再次加入1/3多糖体积的氯仿/正丁醇（5∶1）混合液，重复上述操作，至两相间无明显的蛋白沉淀。
（3）胞外粗多糖的精制使用层析柱对胞外多糖进行分离和纯化。层析柱（2.5cm×60cm）填料为Sepharose CL－6B，缓冲液为0.2mol/L NaCl。称取精多糖40mg，用1mL 0.2mol/L NaCl缓冲液溶解，过0.22μm的水膜，上柱，用缓冲液以1mL/min的流速洗脱，部分收集器收集，5min/管。每管取1mL，用硫酸－苯酚法检测多糖，用紫外－可见分光光度计在波长280nm处直接检测蛋白。重复上柱3次，按照检测结果将同一组分的多糖收集在一起，浓缩透析（透析袋相对分子质量3500）后，冷冻干燥，即为精制多糖。
血红密孔菌胞外多糖的纯化结果见图1.7。由图可知，Sepharose CL－6B羧甲基琼脂糖凝胶柱分别分离血红密孔菌搅拌式发酵罐［图1.7（1）］和气升式发酵罐［图1.7（2）］胞外多糖，均得到一个组分。重复上柱3次，得到的检验结果一致。气升罐组分对应的样品收集管中，有少量的蛋白吸收峰，说明组分中可能含有部分糖蛋白。将组分收集起来，浓缩、透析、冷冻干燥，得到血红密孔菌搅拌罐和气升罐胞外多糖纯品。
图1.7 血红密孔菌胞外多糖经Sepharose CL－6B柱后多糖和蛋白的测定结果
（●490nm测定多糖，〇280nm测定蛋白）
（1）凝胶层析测定分子质量将Sepharose CL－6B羧甲基琼脂糖凝胶层析柱（2.5cm×60cm），用0.2mol/L NaCl溶液按1mL/min的恒定流速平衡24h。蓝色葡聚糖（MW2000ku）和各标准糖的上柱浓度均为25mg/mL，先用蓝色葡聚糖洗脱得到外水体积V0，再分别用分子质量（ku）为T10、T40、T70、T150的标准品上柱。分别取流出液1mL，用苯酚－硫酸法在490nm波长处检测糖峰，分别求得它们的洗脱体积Ve。以Kav为横坐标，分子质量的对数为纵坐标作图，绘制标准曲线。求得样品的Kav，根据标准曲线求得对应的分子质量。其中Kav和Vt的计算公式如下：
式中 V0——外水体积；
Vt——柱床体积；
Ve——洗脱体积；(www.xing528.com)
D——层析柱直径；
h——层析柱高。
（2）单糖组分分析 称取精制多糖0.003g，加入棕色小瓶中，加入3mL2mol/L的三氟乙酸，于121℃下水解2h；用0.22μm的水相滤膜过滤，取滤液，使用旋转蒸发器旋干，加入2mL左右甲醇再次蒸干，重复3次；加入0.9mL吡啶溶解，再加入0.1mL BSTFA∶TMCA（99∶1），80℃保存2h；用0.22μm有机膜过滤于气相瓶中，即可用于进样。使用的气相条件：HP－5 MS 60m色谱柱，进样量0.1μL，分流比50∶1，延迟时间7min，进样口280，传输线280。升温程序：起始温度60℃，以5℃/min的速度升温至280℃，保持20min。
（3）红外光谱法 称取一定量的多糖样品送样检测。
（4）不同温度下胞外多糖的稳定性变化 称取15mg多糖样品送样，从室温升高到700℃。
凝胶层析测定血红密孔菌胞外多糖分子质量。
如图1.8所示，血红密孔菌搅拌罐和气升罐胞外多糖的分子质量分别为462.977ku和54.999ku，搅拌罐胞外多糖的分子质量约为气升罐的8.42倍。
图1.8 Sepharose CL－6B层析柱测定血红密孔菌EPS分子质量
（1）血红密孔菌胞外多糖单糖组分分析 不同搅拌方式下血红密孔菌胞外多糖气相色谱分析结果见表1.1。由表可知，血红密孔菌搅拌罐胞外多糖含有7种单糖，且主要单糖成分为甘露糖42.01%，葡萄糖29.61%，半乳糖12.31%（甘露糖∶葡萄糖∶半乳糖＝3.41∶2.41∶1）。气升罐胞外多糖含有6种单糖，主要单糖成分为葡萄糖90.78%，甘露糖4.40%，半乳糖2.93%（葡萄糖∶甘露糖∶半乳糖＝30.98∶1.50∶1）。
表1.1 血红密孔菌胞外多糖气相色谱图分析对比表
（2）血红密孔菌胞外多糖红外光谱分析 不同搅拌方式下血红密孔菌胞外多糖红外光谱对比图见图1.9，红外光谱图分析结果见表1.2。
由图1.9和表1.2可知，2.92×103cm－1左右有吸收峰，这是糖类C—H键的伸缩振动，是糖类的特征吸收峰；在1.64×103cm－1、1.07×103cm－1左右有吸收峰，说明有羧酸存在；在1.1×103～1.01×103cm－1之间出现3个吸收峰是常见的吡喃糖环内酯和羟基的共振吸收峰，其中1.1×103cm－1左右处中等吸收峰、1.07×103cm－1处强的吸收峰和1.02×103cm－1处很强吸收峰是糖环内酯C—O—C特征吸收峰，为C—O—C的不对称伸缩振动，构成了糖类的特征吸收峰，也是葡聚糖典型的红外光谱信号；在指纹图谱区域8.9×102cm－1左右有吸收峰为β－吡喃糖苷键的特征吸收峰，是由于β－吡喃糖苷键C—H变形振动造成的；在8.0×102左右处有中等吸收峰说明有甘露糖结构；在6.1×102cm－1存在吸收峰为溶剂残留峰。血红密孔搅拌罐多糖在1.34×103～1.17×103之间出现阶梯异峰主要是由于脂肪烃基的C—H弯曲振动，脂基的C—O—C及脂肪酮基团产生了振动吸收峰，这可能是在酯中存在α和β构型，引起多重吸收峰的出现；综上所述，血红密孔搅拌罐胞外多糖和气升罐胞外多糖均为含有甘露糖和葡萄糖结构的酸性β－吡喃糖。
图1.9 血红密孔菌胞外多糖红外光谱对比图
表1.2 血红密孔菌胞外多糖红外光谱分析结果
（3）不同温度下血红密孔菌胞外多糖的稳定性变化 在不同的应用领域，多糖的热稳定性是很重要的，热重分析是通过测定不同温度下多糖质量的变化来确定多糖的热稳定性。不同搅拌方式下血红密孔菌热重分析见图1.10。
如图1.10所示，血红密孔菌搅拌罐胞外多糖和气升罐胞外多糖的降解温度（Td）分别为152℃和116℃，所以当温度高于降解温度时，多糖会发生分解现象。另外，搅拌罐和气升罐胞外多糖急剧降解温度分别为298℃和177℃，且最终残留量分别为25.61%和29.24%。综上所述，血红密孔菌搅拌罐和气升罐胞外多糖均表现出较高的热稳定性，而且搅拌罐和气升罐胞外多糖分别表现出不同的热稳定性和降解行为，这可能是由于含有不同的单糖组成成分。
图1.10 不同温度下血红密孔菌胞外多糖稳定性变化
多糖的抗氧化活性应用研究试验方法如下。
（1）水杨酸法测定胞外多糖·OH的清除能力 实验组分别加入1mL不同浓度的多糖溶液、1mL 9.0mmol/L FeSO4溶液、1mL 9.0mmol/L水杨酸－乙醇溶液，最后分别加入1mL 8.8mmol/L H2O2启动反应，37℃反应30min，用蒸馏水调零，在510nm下测量各浓度的吸光度。空白组以蒸馏水替代多糖溶液，对照组以蒸馏水替代8.8mmol/L H2O2溶液。均平行3次，取其平均值。按照公式（1.3）计算羟基清除率。以胞外多糖浓度为横坐标，羟基清除率为纵坐标作图。
式中 A0——空白组的吸光度；
Ax——加入多糖溶液后的吸光度；
Ax0——对照组的吸光度。
（2）DPPH法测定胞外多糖·DPPH的清除能力 实验组分别加入2mL不同浓度的多糖溶液及2mL 0.1g/L的DPPH自由基50%乙醇溶液，摇匀，于25℃温度下放置1h，用50%乙醇溶液调零，在517nm波长下测定其吸光度。空白组以蒸馏水替代多糖溶液，对照组以50%乙醇溶液替代0.1g/L的DPPH自由基50%乙醇溶液。平行3次，取其平均值。按照式（1.4）计算·DPPH清除率，以胞外多糖浓度为横坐标，·DPPH清除率为纵坐标作图。
式中 Ai——实验组吸光度；
Aj——对照组吸光度；
A0——空白组吸光度。
血红密孔菌抗氧化活性见图1.11。如图1.11（1）所示为血红密孔菌搅拌罐和气升罐胞外多糖羟基清除率结果对比。结果表明，随着胞外多糖浓度的增加，其对羟基自由基的清除能力呈增大趋势，且搅拌罐胞外多糖的最大羟基清除率稍高于气升罐胞外多糖最大羟基清除率。搅拌罐和气升罐胞外多糖浓度分别达到14mg/mL和18mg/mL的时候羟基清除率达到最大，分别为60.42%和58.11%。如图1.11（2）所示为血红密孔菌搅拌罐和气升罐胞外多糖·DPPH清除率结果对比。结果显示，·DPPH清除率随着胞外多糖浓度的增加而增加，且搅拌罐胞外多糖的清除率高于气升罐。搅拌罐中当浓度达到5mg/mL的时候羟基清除率达到最大为46.36%，气升罐中当浓度达到5mg/mL的时候清除率达到最大为30.34%，这些结果显示，二年残孔菌搅拌罐和气升罐胞外多糖均具有较高的自由基清除能力，且搅拌罐胞外多糖的抗氧化能力高于气升罐胞外多糖。
图1.11 血红密孔菌胞外多糖抗氧化能力浓度效应图
（●搅拌罐，〇气升罐）
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