南开化学：植物免疫调控创制新农药

农业是国民经济的基础，2012年，习近平总书记指出“只有把饭碗牢牢端在自己手中才能保持社会大局稳定”。粮食生产的关键环节在于植物保护，农药是其不可或缺的重要手段和国民经济的重要战略物资及粮食安全的重要保障。历史上，我国的植保用药长期依赖于跨国垄断的公司，新农药创制更是受制于西方国家。近年来，我国的新农药创制虽然有了长足的发展，但创制的精力重点集中在针对靶标虫菌草上，被保护植物自身防御能力的利用被忽视。植物虽然无法主动出击应对靶标虫菌草的危害，但它们能充分利用自身的生理生化特点代谢出防御有害生物的化学物质，最成功的范例是植物激活剂。

植物激活剂是指其本身或其代谢产物无直接的抗病活性或者直接抗病活性很低，但它的使用可以显著提高植物自身的免疫防御能力，从而使植物产生持久、广谱而滞后的抗病性；与传统农药比较，植物激活剂直接作用于植物而非危害植物的病原物，可以避免病原物对药剂产生抗药性，是真正意义上的“绿色生态农药”。传统农药主要抑制虫菌草生理过程中的关键靶酶，而植物激活剂是促进并加强被保护植物自身木质素的合成，使植物细胞壁加厚，从而在物理作用机制的层面阻碍病原物的入侵；它还能利用植物内源抗病信号分子如水杨酸、茉莉酸和乙烯以及一氧化氮将植物产生的抗病信号传导到植物整株，启动植物抗病相关酶如苯丙氨酸解胺酶、几丁质酶和过氧化物酶以及病程相关蛋白基因的表达，使植物产生过敏反应并在生理生化和分子生物学的层面阻碍病原物的侵染。已成功开发的植物激活剂主要包括：化学源的苯并噻二唑（BTH）、噻酰菌胺（TDL）、异噻菌胺、烯丙异噻唑（PBZ）、Dichlobentiazox；生物源的Harpin蛋白和虎杖的整体提取物等。甲噻诱胺和氟唑活化酯以及从极细链格孢菌（Alternaria tenuissima）中分离出的植物激活蛋白PeaT1和Hripl（6%寡糖·链蛋白可湿性粉剂）是我国具有自主知识产权的创新植物激活剂。然而，植物激活剂原始的作用机制和作用靶标至今未知，已成为制约该领域发展亟需解决的“卡脖子”关键科学问题。

范志金，中共党员，1968年出生，1991年从西南师范大学化学系获得理学学士学位，1994年从北京农业大学农业应用化学系获得理学硕士学位，随后分配到四川师范大学化学系任教。1997年考入中国农业大学农业应用化学系攻读博士学位，2000年毕业并获得农学博士学位，后返回四川师范大学化学系任教。2001年调到南开大学化学学院从事“农药生物学”“农药生物学实验”和“杀菌剂作用原理”的教学工作及新农药创制与其靶标发现的研究工作，2008年晋升教授；2014被聘为博士生导师。2001—2005年曾任南开大学元素有机化学研究所生物测定研究室主任。担任天津市化工学会农药分会秘书长、中国植物保护学会农药学分会委员和《农药学学报》编委。以2003年开始执行的国家自然科学基金面上项目“植物激活剂创制的基础研究”（30270883）为起点，开启了艰苦而卓有成效的植物激活剂作用机制和新型植物激活剂的创制研究，先后构建了创制植物激活剂的生物活性筛选和作用机制研究平台，发现了甲噻诱胺的诱导抗病活性并联合利尔化学股份有限公司成功实现了其新农药登记。研究团队利用具有自主知识产权的高活性杀菌先导化合物YZK-C22发现了杀菌剂潜在作用新靶标丙酮酸激酶；基于天然产物先导优化发现了高活性稠三环螺内酯抗植物病毒先导骨架及其交联病毒外壳蛋白的抗植物病毒新机制。

2003年，我国新农药创制正值起步阶段，当时植物激活剂的筛选体系和活性评价方法未见文献报道，因此，植物激活剂的创制必须从零（构建筛选体系）开始。得益于在北京农业大学硕士阶段害虫抗药性专业和中国农业大学农药学专业博士学习期间的背景，范志金副教授充分认识到了植物激活剂在植物病害综合防治中的重大意义；加之受到南开大学杨石先等老一辈爱国农药科学家事迹和沈阳化工研究院为了保护我国农业和农民的利益而刻苦攻关开发出吡虫啉影响的震撼和鼓舞，范志金研究团队经过一个自然科学基金3年的艰苦努力，在反复探索试验后，最终以BTH和TDL及BABA为植物激活剂的阳性对照，以DHT为直接抗病毒药剂的阳性对照，以苯并-1，2，3-噻二唑-7-甲酸为抗病毒活性和诱导抗病活性测试的阴性对照，该课题组成功开发了诱导烟草抗烟草花叶病毒和诱导水稻抗水稻稻瘟病菌以及诱导黄瓜抗黄瓜炭疽病菌的植物激活剂筛选平台。

在进行BTH的HPLC定量分析配制标样时，最初范志金错误使用了甲醇做溶剂导在致分析过程中溶剂与BTH发生酯交换而失败（后用乙腈为溶剂得以解决）。研究团队对失败的过程进行了总结和反思：为什么先正达要使用如此不稳定的硫代甲酸酯呢？一定是S原子发挥了很好的诱导抗病活性，为了克服稳定性问题，他们设计合成了苯并-1，2，3-噻二唑7位酰胺键联噻唑胺的衍生物，发现Ⅰ具有很好的诱导抗病活性，考虑到苯并-1，2，3-噻二唑-7-甲酸的合成成本高，能否直接去掉苯环改用1，2，3-噻二唑呢？研究团队随后设计合成了4-甲基-1，2，3-噻二唑-5-甲酸与噻唑胺缩合的酰胺Ⅱ，发现了试验代号为SZG-7的化合物有很好的诱导抗病活性，并取得了甲噻诱胺的中文通用名（图1）。

图1　植物激活剂甲噻诱胺的创制历程

研究团队利用前述筛选体系仔细开展了大量、系统的生物活性验证和作用机制研究，从甲噻诱胺对稻瘟病菌侵染循环各阶段的生长发育与对寄主植物水稻自身以及水稻稻瘟病菌和水稻之间互作的影响验证了其诱导抗病活性，利用基因工程构建的烟草花叶病毒（TMV-EGFP）与本氏烟草体系的研究发现：在钝化模式下，对照药剂宁南霉素能有效抑制TMV的侵染和增殖，而甲噻诱胺无钝化效果；但甲噻诱胺具有很好的诱导抗病活性，100μg/mL浓度下能有效抑制TMV的侵染，效果与BTH和TDL效果相当；阴性对照虫酰肼无任何抗病毒活性。

甲噻诱胺及其相关专利于2009年7月10日成功实现了向利尔化学股份有限公司的专利权转让。得益于参与李正名院士单嘧磺隆和单嘧磺酯新农药开发过程积累的经验，随后南开大学与利尔化学股份有限公司合作开展了产业化开发，甲噻诱胺于2013年8月26日取得我国新农药临时登记证（96%甲噻诱胺原药登记证号：LS20130370；25%甲噻诱胺悬浮剂登记证号：LS20130369）；2016年12月23日取得我国新农药登记证（96%甲噻诱胺原药登记证号：PD20170015；25%甲噻诱胺悬浮剂登记证号：PD20170014）；2018年4月18日，24%甲噻·吗啉胍悬浮剂也取得我国新农药登记证：PD20181410（图2）。

图2　24%甲噻·吗啉胍悬浮剂农药登记证

研究团队还发现了多个比甲噻诱胺活性更高的新型3，4-二氯异噻唑。植物病虫危害造成的伤口给后续病原物的再次入侵提供了机会，研究团队基于农药代谢的原理，以噻二唑和异噻唑类诱导抗病活性亚结构，开展了基于诱导抗病活性的杀虫剂和杀菌剂创制，以充分利用目标分子的杀虫和杀菌活性及降解产物的诱导抗病活性，避免农药混用的麻烦并有效降低后续杀菌剂的用量以保护农田生态环境。南开大学开展的兼具诱导抗病和杀虫活性的飞防新农药创制发现了高活性含砜（硫）亚胺和N-氰基砜（硫）亚胺的邻甲酰氨基苯甲酰胺，已获自主知识产权，为合作单位江西天人生态股份有限公司采用对传播媒介昆虫天牛的防治来有效控制松材线虫作出贡献，双方共同申报并获得2018年度江西省科学技术进步二等奖（图3）。

图3　江西省科学技术进步二等奖（2019年9月30日）

研究团队还设计合成并发现了作用于细胞色素bc1复合物的甲氧基丙烯酸酯类新化合物（如CL04-22D）和氧化固醇结合蛋白的新型哌啶基噻唑衍生物（如WQF2-113）均兼具有很好的诱导抗病活性和杀菌活性（图4），研究结果取得自主知识产权并于2017年和2019年发表在国际农业领域的顶级期刊J.Agric.Food Chem上，执行该研究的博士生陈来同学的论文获评2019年度南开大学优秀博士论文；部分研究内容与天津市农业质量标准与检测技术研究所合作申报并获得了2019年度天津市科学技术进步二等奖。（图5）

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图4　兼具诱导活性和杀菌活性的新型高活性甲氧基丙烯酸酯和哌啶基噻唑化合物

图5　陈来优秀博士学位论文证书（2019年）和范志金天津市科学技术奖证书（2020年）

研究团队以自主知识产权的高活性杀菌先导化合物3-（4-甲基-1，2，3-噻二唑-5-基）-6-（三氯甲基）-1，7a-二氢［1，2，4］三唑［3，4-b］［1，3，4］噻二唑（YZK-C22）（EC50为2.5—12.5μg/mL，拜耳公司验证结果为1.6—23.7 μg/mL）开展了作用机制的挖掘：酵母突变体库的抗性株系筛选和对DNA复制影响及转录组学与蛋白质组学结合药物亲和力反应靶点稳定性（DARTS）研究发现，YZK-C22竞争性抑制菌体三羧酸循环中的关键酶丙酮酸激酶（PK），其Ki为3.33±0.28μmol/L，PK是农用杀菌剂的原创性潜在新靶标（图6）。以此靶标设计合成并发现了高活性异噻唑联嘌呤类PK抑制剂。研究结果分别发表在2018年和2021年的J.Agric.Food Chem上。

图6　YZK-C22作用于丙酮酸激酶的杀菌作用机制

范志金团队在构建植物激活剂筛选体系的基础上开展了系统的创制研究，成功创制出我国第一个具有自主知识产权的植物激活剂甲噻诱胺，并取得新农药登记证，实现了专利成果的产业化转化，为农药减施战略的实施提供了新的选择。

新农药创制的创新分4个层次：农药创制新理论的创建，农药新作用靶标的发现、农药新先导化合物的发现及农药新品种的研发。研究团队在新靶标、新先导的发现及新品种的研发领域取得创新和突破，尤其是杀菌剂潜在新作用靶标PK的成功发现是我国继周明国教授发现创制杀菌剂氰烯菌酯破坏小麦赤霉病菌细胞骨架和肌球蛋白-5这一全新作用靶标后的又一个原始创新，为新农药创制和南开大学农药学学科的建设作出了贡献。

植物激活剂甲噻诱胺的成功创制促进了我国利用植物自身免疫调控机制进行植物保护的发展，该药被工业和信息化部于2016年10月21日发文《产业技术创新能力发展规划（2016—2020年）》列为“石化和化学工业重点发展方向”中“化肥农药领域重点发展的方向”：“……，甲噻诱胺等农药系列新品种，绿色生态农药分子设计和系统优化重大共性关键技术……”

研究团队因杀菌剂潜在新靶标PK的发现受邀在2019年5月召开的IUPAC农药会上做了题为“Discovery of Pyruvate Kinase as a Fungicide Target by DARTS”的报告。由于创新性突出，组委会邀请研究团队参编了由Prof.Dr.ir.Sven Mangelinckx和Prof.Dr.Peter Maienfisch主编，Elsevier Inc.出版的书籍《Recent Highlights in the Discovery and Optimization of Crop Protection Products》中的第29章“Discovery and validation of pesticide novel target：take pyruvate kinase as an example”，该书已于2021年3月正式出版发行。

研究团队的后续研究获得了国家重点研发计划项目“作物免疫调控与物理防控技术及产品研发”子课题“作物免疫调控先导优化及产品研发”（2017YFD0200903）和第三批天津市人才发展特殊支持计划：高层次创新创业团队项目“作物免疫调控创新团队”的支持。与俄罗斯乌拉尔叶利钦大学著名国际杂环研究专家Vasiliy Bakulev的长期合作研究获得俄罗斯基础研究基金（18-316-20018）和我国科技部中俄国际科技合作项目的支持（2014DFR40030），合作研究拓展了南开大学新农药创制领域的国际影响，并协助俄方培养了多名博士生，其中Polina Kroptina（2006）和Tatiana Kailinina（2011）毕业后留校任教。

成果完成人：范志金、石祖贵、杨知昆、刘秀峰、刘凤丽、赵斌、马琳、米娜、陈来、张乃楼、李岳东、朱玉洁、王炜博、鲍丽丽、付一峰、贾俊超、张海科、张永刚、苑建勋、吴启凡、吴琼、王唤、国丹丹、左翔、郑琴香、李娟娟、黄杰、赵晖、王盾、毛武涛、王守信、房震、宗广宁、姬晓恬、钱晓琳、高卫、齐欣、董静月、吕游、郝泽生、洪泽宇、郭晓凤、张越、范谦、殷勇、邱丰、范志银、V.A.Bakulev。

【注释】

[1]1亩≈0.067公顷。