常用染色方法：革兰氏染色和萋－纳氏抗酸染色法

(一)革兰氏染色法

革兰氏染色法是细菌学中最重要的鉴别染色法。

1.染液

结晶紫、卢革氏碘液、95%酒精、石碳酸复红(或番红)。

2.染色法

实验流程:涂片→干燥→固定→结晶紫初染(1～2 min，水洗)→卢革氏碘液媒染(1 min，水洗)→95%乙醇脱色(至无色，约30 s，水洗)→番红复染或石碳酸复红复染(2～3 min，水洗)→干燥→镜检。

(1)将结晶紫染液滴在已固定的涂片上，染1～2 min后，用水洗去剩余染料。

(2)滴加卢革氏碘液，1 min后水洗。

(3)滴加95%乙醇脱色，摇动玻片至流出的乙醇无紫色为止，水洗。

乙醇脱色是革兰氏染色操作的关键环节。脱色不足，阴性菌被误染成阳性菌；脱色过度，阳性菌被误染成阴性菌。脱色时间一般为20～30 s。

(4)滴加番红染液复染，2～3 min后水洗，然后用吸水纸吸干，用油镜观察。

3.镜检结果

革兰氏阳性菌(G＋)被染成紫色，革兰氏阴性菌(G－)被染成红色。

无菌操作及做涂片过程见图Ⅲ－1，革兰氏染色法操作及染色结果见图Ⅲ－2。

图Ⅲ－1　无菌操作及涂片过程

图Ⅲ－1　无菌操作及涂片过程(续)

图Ⅲ－2　革兰氏染色法操作及染色结果(见彩插)

革兰氏染色的关键环节如下:

(1)涂片不宜过厚，以免脱色不完全，造成假阳性。

(2)乙醇脱色时间。

(3)菌龄:应选择指数生长期的细菌培养物进行革兰氏染色。培养时间过长或死亡及部分自溶，改变了细菌细胞壁的通透性，造成阳性菌的假阴性反应。

(4)火焰固定不宜过热。

(5)媒染剂的作用:媒染剂的作用是增加染料和细胞之间的亲和性或吸附力，即以某种方式帮助染料固定在细胞上，使之不易脱落。

(二)萋－纳氏抗酸染色法

1.染液

石碳酸复红、3%盐酸酒精、碱性美蓝。

2.染色法

(1)用接种环取菌液涂于玻片上做成薄膜，自然干燥后经火焰固定。

(2)滴加石碳酸复红液于涂片上，用玻片夹夹住涂片以微火加热，保持液体冒蒸气约5 min，切勿蒸发至干或使染液沸腾。

(3)冷却后，水冲洗。

(4)以3%盐酸酒精液脱色，至片上红色全部脱去为止。

(5)水冲洗后，以碱性美蓝液复染1 min，水洗，待干，镜检。

3.染色结果

抗酸菌染成红色，非抗酸菌染成蓝色(图Ⅲ－3)。

图Ⅲ－3　抗酸染色结果(见彩插)

(图片来源于网络)

(三)荚膜染色法——黑斯氏法

1.染液

结晶紫(结晶紫饱和酒精液5 mL加蒸馏水95 mL)、20%硫酸铜水溶液。

2.染色法

(1)取有荚膜的细菌涂片，空气中干燥固定，不可加热固定。

(2)滴加结晶紫染液，染色2 min。

(3)用20%硫酸铜液将涂片上的染液洗去，此时切勿再用水洗，用吸水纸吸干残液后镜检。

3.染色结果

菌体及背景呈紫色，菌体周围有一圈淡紫色或无色的荚膜(图Ⅲ－4)。

图Ⅲ－4　荚膜染色结果(见彩插)

(图片来源于网络)

(四)芽孢染色法

1.染液

5%孔雀绿水溶液、0.5%番红水溶液。(www.xing528.com)

2.染色法

改良的Schaeffer和Fulton氏染色法:

(1)菌悬液的制备:加1～2滴水于小试管中，用接种环挑取2～3环菌苔于试管中，搅拌均匀，制成浓的菌悬液。

(2)加染色液:加5%孔雀绿水溶液2～3滴于小试管中，用接种环搅拌使染料与菌液充分混合。

(3)加热:将试管浸于沸水浴的烧杯中，加热染色15～20 min。

(4)涂片:挑取数环试管底部的菌液于洁净的玻片上，涂成薄膜，晾干。

(5)固定:将涂片通过酒精灯火焰3次，温热固定。

(6)脱色:水洗至流出的水无绿色为止。

(7)复染:用番红染液染色3～5 min，倾去染液，用吸水纸吸干残液(不水洗)，镜检。

Schaeffer和Fulton氏染色法:

(1)制片:涂片、干燥、固定。

(2)加染色液:加数滴孔雀绿染液于涂片上，用玻片夹夹住玻片一端，在微火上加热至染料冒蒸气(但不沸腾)，切勿使染料蒸干，必要时可添加少许染料，加热时间从冒蒸气开始计算维持5 min。

(3)水洗:倾去染液，待玻片冷却后，用水洗至流出的水无绿色为止。

(4)复染:用番红染液染色5 min，水洗，用吸水纸吸干，镜检。

3.染色结果

芽孢呈绿色，芽孢囊及菌体为红色(图Ⅲ－5)。

图Ⅲ－5　芽孢染色结果(见彩插)

(图片来源于网络)

注意事项:

(1)所用菌种应掌握菌龄，以大部分细菌已形成芽孢为宜，取菌不宜太少。

(2)用改良法时，从小试管取菌液时应先用接种环充分搅拌，然后再挑取菌液，否则菌体沉于管底，涂片时菌体太少。

(3)加热染色时要随时添加染色液，不可使染液沸腾，切勿让标本干涸。加热温度不能太高。

(4)一定要等玻片冷却后再进行水洗或加复染液进行复染。

(五)鞭毛染色法——镀银法染色

1.染色液

染液A(单宁酸5 g、FeCl3 1.5 g、蒸馏水100 mL、15%福尔马林2 mL、1% NaOH 1 mL)、溶液B(AgNO3 2 g、蒸馏水100 mL)。

2.染色法

(1)制片:取一洁净玻片，在一端滴一滴蒸馏水，用接种环挑取少量菌体在载玻片的水滴中轻蘸几下，将玻片倾斜，使菌液随水滴缓缓流到另一端，然后平放于空气中干燥。

(2)涂片干燥后，滴加A液染3～5 min，用蒸馏水洗，或用B液冲去残水。一定要将A液充分洗尽，再加B液。

(3)滴加B液，将载玻片于酒精灯上稍加热，使其微冒蒸气且不干，一般染0.5～1 min，直至显褐色时立即水洗，自然干燥后镜检。

3.染色结果

菌体为深褐色，鞭毛为褐色(图Ⅲ－6)。

图Ⅲ－6　鞭毛染色结果(见彩插)

(图片来源于网络)

注意事项:

(1)所用菌种应掌握菌龄，以培养10～14 h的细菌为宜，取菌时宜取斜面和冷凝水交接处培养物或平板菌落边缘的菌苔。

(2)玻片要高度清洁，光滑、不带油渍(将水滴在玻片上，无油渍玻片水能均匀散开)。

(3)使用新鲜的染色液，充分洗去A液再加B液和掌握好B液的染色时间均是确保鞭毛染色成功的重要环节。

(六)细菌的单染色法

单染色法是用一种染料使微生物着色，其只能观察细菌的形态结构、排列等，不能鉴别微生物。进行单染色所用的染料通常为美蓝、碱性复红、结晶紫等。

1.染色液

美蓝染液，或碱性复红染液或结晶紫染液。

2.染色法

(1)涂片:取一张清洁无油脂的载玻片，加上一环生理盐水(如为液体标本或液体培养物可不加盐水)。用灭菌的接种环取菌落(纯培养物可取菌苔)少许，与生理盐水混匀，涂布成薄膜。液体培养物直接挑取菌液涂片。

(2)干燥:一般在室温中自然干燥。若须加速干燥，可在火焰上方的热空气中加温干燥，但切勿紧靠火焰，以免标本被烤焦。

(3)固定:手持玻片，将背面迅速通过酒精灯火焰3次。

(4)染色:加美蓝染液(或碱性复红染液或结晶紫染液)1～3滴，染色1 min，水洗，吸干，镜检。

3.染色结果

美蓝染液着色慢，时间长，菌体呈蓝色；结晶紫染液着色深而迅速，菌体呈紫色；碱性复红染液着色快，时间短，菌体呈红色。