食品中西地那非类快速检测成果

案例导入

案例：2017年3月20日，湖北省黄冈市团风县公安局食品药品犯罪侦查大队接到团风县食药监局移送的一起涉嫌销售有毒有害食品案件。据团风县食药监局办案人员介绍，2016年12月26日，该局接到某药店负责人举报，称其从一名姓何的男子手中购进的一批“伟哥”质量存疑，请求核查。经抽样送检，该样品中含有化学物质“西地那非”，属于有毒有害食品。

讨论：1.西地那非是什么，为什么不能添加在食品中？2.我们怎样快速检测出保健食品中的西地那非？

增强免疫力类保健食品是指帮助机体维持正常免疫能力的产品。免疫系统行使对外防御和对内维稳的功能，通过识别“自己”和“异己”，保护和耐受属于自己的器官、组织、细胞、分子等“同类”物质，抵御和排斥不属于自己的细菌、毒素和不正常的癌变细胞等“异类”物质。“免疫力”指机体免疫系统的防御、监视、排斥和耐受能力。“免疫力低下”指健康人群由于营养不良、过度疲劳、过量运动、生活不规律、精神压力等因素所致的免疫力降低。

缓解体力疲劳类保健食品是指缓解因体力负荷和运动引起的体力下降感觉的产品。“体力疲劳”与身体承受的体力负荷大小直接相关，也与身体运动素质、饮食、情绪等因素有关。产品适合体力劳动和运动引起的疲劳感。

为增强产品疗效，一些不法商家常在增强免疫力、缓解体力疲劳这两类保健食品中添加具有促进疗效的化学药物，其中西地那非的检测频率最高。

西地那非（Sildenafil）是一种白色结晶粉末，分子式为C22H 30N6O4S，密度为1.39 g/cm3，又译昔多芬，是一种研发治疗心血管疾病药物时意外发明出的治疗男性勃起功能障碍药物，其商业名称“伟哥”。此类药物均属于处方药物，在没有医师指导的情况下，长期大量服用这种添加了化学药物成分的保健食品，有可能对身体造成极大损害。西地那非已禁止添加在保健食品中。

增强免疫力、缓解体力疲劳类保健食品中西地那非类的快速检测方法，主要有胶体金免疫层析法和激光拉曼光谱法。

一、胶体金免疫层析法

1.范围

本方法规定了声称具有增强免疫力、缓解体力疲劳功能保健食品中西地那非和他达拉非的胶体金免疫层析快速筛查方法。

本方法适用于声称具有增强免疫力、缓解体力疲劳功能保健食品中西地那非和他达拉非成分的快速。

检出限：固体样品1.0μg/g，液体样品1.0 μg/mL。

2.原理

本方法采用竞争抑制免疫层析原理。样品中的西地那非和他达拉非等物质经提取后与胶体金标记的特异性抗体结合，抑制抗体和试纸条或检测卡中检测线（T线）上抗原的结合，从而导致检测线颜色深浅的变化。通过检测线与质控线（C线）颜色深浅比较，对样品中西地那非和他达拉非成分进行定性判定。

3.试剂及材料

①除另有规定外，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682-2016规定的二级水。

②甲醇：色谱纯。

③三羟甲基氨基甲烷，Tris碱。

④浓盐酸。

⑤吐温-20。

⑥盐酸溶液A：量取浓盐酸16.7 mL，用水溶解并稀释至100 mL。

⑦缓冲液B：称取12.1 gTris碱，加适量水溶解，混勻，用盐酸溶液A调节pH至8.0，加入5.0 g吐温-20搅拌均勻，定容至1000 mL。

⑧参考物质。

参考物质的中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、分子量见表10-1，纯度均≥99%。

表10-1　参考物质的中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、分子量

⑨西地那非标准储备液（1.0 mg/mL）：精密称取适量西地那非参考物质，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇勻，配制成浓度为1.0 mg/mL的标准储备液。-20℃避光保存，有效期1年。

⑩西地那非标准工作液（10 μg/mL）：精密移取适量西地那非标准储备液（1.0 mg/mL）分别置于10 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇勻，配制成浓度为10 μg/mL的标准工作液。-20℃避光保存，有效期3个月。

⑪他达拉非标准储备液（0.5 mg/mL）：精密称取适量他达拉非参考物质，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇勻，配制成浓度为0.5 mg/mL的标准储备液。-20℃避光保存，有效期1年。

⑫他达拉非标准工作液（10 μg/mL）：精密移取适量他达拉非标准储备液（0.5 m/mL）分别置于10 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇勻，制成浓度为10 μg/mL的标准工作液。-20℃避光保存，有效期3个月。

⑬材料

西地那非胶体金免疫层析试剂盒及配套的试剂（可选），适用基质为保健食品。

他达拉非胶体金免疫层析试剂盒及配套的试剂（可选），适用基质为保健食品。

4.仪器设备与实验条件

（1）仪器设备

天平：感量为0.1 mg和0.01 g，涡旋混合器，移液器：200 μL、1000 μL、5 mL，离心机：转速可达4000 r/min以上，读数仪：产品配套可使用的检测仪器（可选）。

（2）实验条件

环境条件：温度10～40℃，相对湿度≤80%。

5.分析步骤

（1）试样制备

液体样品充分混勻，半固体、浆体、悬浮液体、固体样品充分均质或粉碎混勻。

（2）试样提取和净化

①液体基质。

量取（0.5±0.02）mL试样于15 mL离心管中，加入4 mL缓冲液B，涡旋混合30s，作为待测液。

②半固体、浆体、悬浮液体、固体。

A.检测西地那非

准确称取试样（0.5±0.01）g于15 mL离心管中，加1 mL甲醇，涡旋30 s，4000 r/min离心2 min或静置2 min。取250 μL上清液于2 mL离心管中，加入750 μL缓冲液B，涡旋混合30s，作为待测液。

B.检测他达拉非

准确称取试样（0.5±0.01）g于15 mL离心管中，加1 mL甲醇，涡旋30 s，4000 r/min离心2 min或静置2 min。取200 μL上清液于15 mL离心管中，加入3 mL缓冲液B，涡旋混合30s，作为待测液。

注：试样提取和净化过程可按照试剂盒说明书操作，不做限定。

（3）测定步骤

①试纸条与金标微孔测定步骤。

吸取200 μL样品待测液于金标微孔中，抽吸5～10次使混合均勻，室温温育5 min；温育结束后，将试纸条吸水海绵端垂直向下插入金标微孔中，室温温育5 min，从微孔中取出试纸条，去掉试纸条下端的吸水海绵，进行结果判定。

注：测定步骤建议按照试剂盒说明书。

②检测卡与金标微孔测定步骤。

吸取200 μL上述待测液于金标微孔中，上下抽吸5～10次使混合均勻。室温温育5 min，将反应液全部加入到检测卡的加样孔中，将金标微孔中全部溶液滴加到检测卡上的加样孔中，温育5 min，进行结果判定。

注：测定步骤建议按照试剂盒说明书。(www.xing528.com)

（4）质控试验

每批样品应同时进行空白试验和加标质控试验。

①空白试验。

准确称取固体空白试样（0.5±0.01）g或量取液体空白试样（0.5±0.02）mL于15 mL离心管中，与试样同法操作。

②加标质控试验。

准确称取固体空白试样（0.5±0.01）g或量取液体空白试样（0.5±0.02）mL于15 mL离心管中，加入适量标准工作液，使西地那非参考物质浓度为1.0μg/g或1.0 μg/mL，与试样同法操作。

准确称取固体空白试样（0.5±0.01）g或液体空白试样（0.5±0.02）mL于15 mL离心管中，加入适量标准工作液，使他达拉非参考物质浓度为1.0μg/g或1.0 μg/mL，与试样同法操作。

6.结果判定

通过对比质控线（C线）和检测线（T线）的颜色深浅进行结果判定。目视判定示意图见图10-1。结果判定也可根据产品说明书进行。

（1）无效

质控线（C线）不显色，表明不正确操作或试纸条无效。

（2）阴性结果

质控线（C线）显色，检测线（T线）颜色比质控线（C线）颜色深或检测线（T线）颜色与质控线（C线）颜色相当，均表示样品中不含待测组分或含量低于方法检测限，判为阴性。

（3）阳性结果

质控线（C线）显色，检测线（T线）颜色比质控线（C线）颜色明显浅或检测线（T线）不显色，均表示样品中待测组分含量高于方法检测限，判为阳性。

（4）质控试验要求

空白试验测定结果应为阴性，加标质控试验测定结果应为阳性。

图10-1　目视判定本意图

7.结论

西地那非或他达拉非在食品中属于非法添加物，故在保健食品中不得检出。

当检测结果为阳性时，应对结果进行确证，确证不得采用快检方法。

8.其他

本方法分析步骤和结果判定可以根据厂家试剂盒的说明书进行，但应符合或优于本方法规定的性能指标。

本方法所述试剂、试剂盒信息及操作步骤是为方法使用者提供方便，在使用本方法时不做限定。但方法使用者应使用经过验证的满足本方法规定的各项性能指标的试剂、试剂盒。

本方法参比标准为：BJS 201710《保健食品中75种非法添加化学药物的检测》、2009030《补肾壮阳类中成药中PDE-5型抑制剂的快速检测方法》、KJ 201901《保健食品中西地那非和他达拉非的快速检测胶体金免疫层析法》。

本方法使用西地那非试剂盒可能与那莫西地那非、豪莫西地那非、羟基豪莫西地那非、伪伐地那非、伐地那非、硫代艾地那非存在交叉反应；他达拉非试剂盒可能与氨基他达拉非、去甲基他达拉非存在交叉反应；当结果判定为阳性应对结果进行确证。

二、激光拉曼光谱法

1.范围

本方法规定了利用激光拉曼光谱法快速检测声称具有增强免疫力、缓解体力疲劳功能保健食品中微痕量西地那非的定性检测方法。

本方法适用于声称具有增强免疫力、缓解体力疲劳功能保健食品中西地那非的快速检测。

本方法检出限为0.1 mg/kg。

2.原理

试样经二步萃取提取后直接测定。样品中的西地那非分子与表面增强试剂混合后，分子吸附在表面增强纳米颗粒上，其拉曼散射信号得到增强，使用便携式激光拉曼光谱仪通过自动判别其特征峰即可定性检测出西地那非。

3.试剂及材料

表面增强试剂A：金纳米溶胶，表面增强试剂B：1%氯化钠水溶液，乙酸乙酯：分析纯，硫酸溶液#0.3 mol/L，离心管：1.5 mL、15 mL。

4.仪器及设备

便携式激光拉曼光谱仪，离心机：转速不低于3900 r/min，天平：感量为0.1 g，粉碎机，研钵。

5.分析步骤

（1）试样制备

液体样品充分混勻，半固体、浆体、悬浮液体、固体样品充分均质或粉碎混勻。

（2）试样提取和净化

称取制备好的样品0.1 g（液体1 mL）于10 mL离心管中，向离心管中加入3 mL乙酸乙醋，祸旋萃取3 min后，离心分层，上层有机相为提取液。吸取0.5 mL提取液于1.5 mL离心管中，加入0.5 mL硫酸溶液，涡旋3 min，离心分层，下层溶液为待测液。

（3）仪器参数

激光功率：200 mW；扫描时间：5 sec；扫描次数：2；平滑参数：4。

（4）测定步骤

依次向检测瓶中加入500 μL纳米金增强试剂A，100 μL待测液，100 μL 1%的氯化钠溶液，混勻上机检测。

6.结果判定

根据谱图1234 cm-1（±5 cm-1）、1525 cm-1（±5 cm-1）和1581 cm-1（±5 cm-1）处特征拉曼光谱，对保健食品中的西地那非进行评估：如同时存在上述特征峰，则可判定样品中含有西地那非；否则，不能证明样品中含有西地那非，需要进一步实验验证。食品中西地那非表面增强拉曼光谱图参见图10-2。

图10-2　西地那非表面增强拉曼光谱图

7.结论

西地那非在食品中属于非法添加物，故在保健品中不得检出。

当检测结果为阳性时，应对结果进行确证，确证不得采用快检方法。

8.其他

①本方法仅用于保健食品中西地那非的快速检测。

②本方法参比标准与规范为：湖北省食品安全快检操作规程。

③拉曼光谱仪一阶光谱峰中心位置重复性为±5 cm-1。